粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03侵染楚雄腮扁叶蜂幼虫的扫描电镜及透射电镜观察

【目的】了解粉红粘帚霉对楚雄腮扁叶蜂幼虫的侵染过程,为粉红粘帚霉对楚雄腮扁叶蜂的致病机理研究提供参考。【方法】利用扫描电镜和透射电镜技术对粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03孢子侵染楚雄腮扁叶蜂幼虫体表过程及其超微结构的变化进行观察研究。【结果】扫描电镜结果显示,接种6 h后,粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03分生孢子成功附着于幼虫体壁的气门、节间膜等部位;接种14 h后,粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03孢子萌发出芽管,并侵入体壁;接种26 h后,孢子和菌丝穿透楚雄腮扁叶蜂幼虫体壁,且菌丝迅速生长;接种72 h后,菌丝穿出虫体表面,并长出产孢结构。透射电镜观察发现粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03菌丝在穿透幼虫体壁过程中,会伴随酶的参与和组织溶解现象;接种6 h后,粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03分生孢子附着于幼虫体壁的两个节间褶间的部位;接种14 h后,分生孢子萌发并进入表皮细胞层分泌物中;接种26 h后,菌丝侵入表皮并扩展蔓延,且在菌丝周围出现电子密度很低的光晕;接种38 h后,皮细胞层细胞排列松弛变成空泡;接种48 h后,菌丝充满虫体,表皮层出现大量菌丝。【结论】粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03孢子及菌丝能寄生楚雄腮扁叶蜂幼虫,并可致其死亡。观察结果准确反映了粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03对楚雄腮扁叶蜂幼虫的侵染过程,并证实了侵染过程中酶与代谢产物的存在。

粉红粘帚霉67-1菌株寄生核盘菌研究

用诱捕法从海南乐东县菜园土壤中获得一株对核盘菌菌核具有强寄生能力的粉红粘帚霉 ( Gliocladium roseum)菌株67-1 ,寄生频率为 1 0 0 %。该菌的 PDA平板回接核盘菌菌核 ,一周后寄生率可达 1 0 0 %。对峙培养发现其对核盘菌有明显的抑菌带。保湿条件下 ,该菌孢子在 2 4h内成功侵入核盘菌菌核。切片显微观察证明该菌能高效侵染菌核 ,造成组织溃解。寄生过程中菌核内蛋白组成发生明显变化。这一菌株在 2 2~ 3 5℃均能很好生长 ,菌丝及产孢最适温度为 2 4℃ ,产孢量大。认为这一菌株具有良好的菌核病生防应用潜力。

粉红粘帚霉化学成分的研究

粉红粘帚霉对名贵药用植物金线莲有明显的促生作用 ,为了从物质角度探讨其可能的促生机理 ,对该菌的化学成分进行了初步研究。从该菌的菌丝体中共分离到 5个化合物 ,通过结构解析 ,确定它们是 :化合物 1 ,6 ,2 2 二烯 3 羟基 5 ,8 过氧麦角甾 ;2 ,麦角甾醇 ;3 ,阿拉伯糖醇 ;4,甘露醇 ;另外一个化合物的结构正在鉴定中。

粉红粘帚霉67-1菌株对水稻纹枯病的抑菌防病作用研究

采用对峙培养法和含毒介质法测定67-1菌株和无菌发酵液对水稻纹枯病菌的抑制作用和对菌核形成的影响;测定67-1菌株孢子悬浮液和无菌发酵液处理不同时间对菌核萌发的抑制作用;采用种子处理和土壤处理的方法测定67-1菌株孢子悬浮液对水稻幼苗生长的影响;通过室内盆栽试验和田间药效试验,测定67-1菌株孢子粉对水稻纹枯病的防病效果。结果表明,67-1菌株及其无菌发酵液对水稻纹枯病菌的菌丝生长、菌核的形成有明显的抑制作用,发酵液60℃处理30min后抑菌率有所下降,121℃处理30min抑菌活性丧失;孢子悬浮液和无菌发酵液处理不同时间菌核萌发率明显下降;67-1菌株孢子悬浮液土壤和种子处理后,能够提高水稻发芽率,促进水稻的生长;750g/hm2的孢子粉对水稻纹枯病有较好的防治作用,田间试验防病效果和保产效果分别达69.1%和22.4%,与20%井冈霉素可湿性粉剂没有显著差异。

粉红粘帚霉67-1菌株原生质体的形成和再生

研究了多种细胞壁降解酶的种类和浓度、酶解时间、菌龄,以及渗透压稳定剂等因素对粉红粘帚霉67-1菌株原生质体形成和再生的影响。结果表明,粉红粘帚霉67-1菌株原生质体形成的适宜条件为:使用溶壁酶(3mg/ml)、蜗牛酶(3mg/ml)、纤维素酶(2mg/ml)的组合酶液酶解时间为2h,菌龄为14h,稳渗剂为NaCl(0·5mol/ml)。在上述条件下,原生质体产量达到9·25×106/ml。将原生质体涂布于含KCl(0·5mol/ml)的再生培养基上,再生率最高。显微观察表明,粉红粘帚霉67-1菌株主要通过顶端和侧位释放原生质体。

土壤因子对生防真菌粉红粘帚霉67-1消长动态的影响

应用实时荧光定量PCR技术,通过室内营养钵土壤人工接种粉红粘帚霉67-1菌株,研究土壤温度、pH、含水率对生防菌粉红粘帚霉在土壤中消长动态的影响。结果表明:在不同温度、含水率和酸碱度的土壤中,菌株67-1种群动态变化曲线基本一致,接种5 d前土壤中67-1拷贝数明显减少,10 d后拷贝数逐渐增加,20 d时达到最高,并维持在这一水平。土壤因子对菌株67-1的定殖量具有显著影响,接种相同时间30℃时土壤中菌株67-1拷贝数增加最快,其次是20℃,10℃最低;土壤pH值为5.0时拷贝数最高,pH为8.0时拷贝数较低,pH为4.0时拷贝数最低;土壤含水率为15%时菌株67-1拷贝数高于含水率25%,但二者差异不显著,表明菌株67-1在土壤中的扩增受土壤含水率影响较小。

粉红粘帚霉1A毒杀线虫活性代谢物的研究

在研究粉红粘帚霉Gliocladium roseum 1A抗线虫活性代谢产物的过程中,活性跟踪分离获得4个化合物。通过UV、IR、MS、1HN-MR、13CN-MR、DEPT、1H-1HCOSY、HMQC、HMBC等波谱分析,鉴定其结构分别与轮枝菌素A、11'-脱氧轮枝菌素、sch52900和sch52901相同。首次报道这4个化合物对线虫的毒杀活性。

土壤中生防菌粉红粘帚霉67-1的荧光定量PCR检测方法

为了建立重要植病生防真菌粉红粘帚霉67-1菌株的荧光定量PCR检测方法,收集了目标菌株、粘帚霉属其它多个种及近缘木霉属的多个种等共18个菌株,并进行了ITS区测序。以200bp左右差异较大区段设计出探针和引物。该引物及探针能有效扩增目标菌株,而其它17株非目标菌株没有扩增,表明所设计的引物和探针具有高度特异性。以目标菌株的阳性克隆质粒作为标准物质,建立了标准曲线,相关系数为0.9989,且扩增效率较高(95.0%)。经过土壤样品试验,得出标准曲线相关系数为0.9979,表明所建立的粘帚霉67-1菌株荧光定量PCR检测方法合理有效、快速实用,适合生态学研究的要求。

重寄生菌粉红粘帚霉SS-1-1菌株的发酵条件优化

采用正交试验和单因素试验对粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)SS-1-1菌株发酵条件的优化进行了研究。SS-1-1菌株最佳发酵培养基配方为:麸皮40g/L,玉米粉50g/L,豆饼粉20g/L,KH2PO4 0.5g/L;最佳发酵条件为:培养基初始pH值为4.5,发酵温度为28℃,摇床转速为200r/min,最佳培养时间为5d。

限制性内切酶介导的粉红粘帚霉67-1转化体系构建

本文将含有潮霉素抗性基因(hph)的质粒pAN7-1通过限制性内切酶介导法转入植病生防真菌粉红粘帚霉Clonostachys rosea 67-1中,并由此建立该生防真菌的遗传转化体系。研究结果表明,PEG介质含量、限制性内切酶种类和浓度、质粒形态和反应时间对转化效率具有显著的影响。当质粒经线性化后加入40%PEG3350和20 U HindⅢ,室温下转化10 min时,转化效率可达到30～40 CFU.μg 1质粒DNA。PDA平板上连续培养3代,再转接到潮霉素抗性平板中,获得遗传稳定的转化子。PCR检测、Southern杂交和Real-time PCR检测等证明hph基因已整合到基因组中,且多为单拷贝插入。对随机挑取的50个转化子生长性状的测定结果表明,20%的转化子在PDA培养基中生长较快,12%的转化子产孢水平较高;另有16%～20%的转化子生长缓慢、产孢量减少;还有4%的转化子生长微弱,且无明显产孢现象。上述方法可以成功用于在粉红粘帚霉中引入外源基因,为今后生防粘帚霉高效工程菌株的构建提供了依据。

粉红粘帚霉对玉米茎基腐病的抑菌防病作用

为研究粉红粘帚霉对玉米茎基腐病的抑菌防病作用,采用PDA平板和水琼脂对峙培养法测定粉红粘帚霉的抑菌作用,采用扣皿法测定挥发性代谢产物的抑菌作用,采用含毒介质法测定发酵液的抑菌作用,测定孢子液对玉米种子的促生作用,通过室内盆栽试验测定粉红粘帚霉的苗期防病效果.结果表明:粉红粘帚霉对玉米茎基腐病具有生防潜力.病菌菌落扩展受到明显抑制,粉红粘帚霉菌丝重寄生病菌菌丝,导致菌丝细胞原生质颗粒化、溃解;挥发性代谢产物对病菌菌丝生长无抑制作用;JM发酵滤液对病菌菌丝生长具有抑制作用,且第9天的抑菌活性最好,菌丝生长抑制率为50%;孢子液可以在一定程度上提高种子萌发率和单株鲜质量;粉红粘帚霉对苗期玉米茎基腐病具有一定的防病效果.

粉红粘帚霉67-1转几丁质酶基因转化子生物学特性及高效工程菌株的筛选

通过原生质体转化法,制备粉红粘帚霉67-1转几丁质酶基因的转化子,通过潮霉素抗性平板初筛及PCR复筛,共获得530个转化子。对其生物学性状测定表明,3株转化子产孢量明显增加,3株转化子生长量显著提高,比色法测定发现40%的转化子几丁质酶活高于野生型菌株,对峙试验发现25%的转化子抑菌效果明显提高。初步筛选出生长快速、产孢量多、几丁质酶高、对菌核抑制效果明显的转化菌株TC-8、TC-64、TC-298、TC-406、TC-514,对其进行抗大豆菌核病防效试验测定,结果表明TC-8、TC-64、TC-298转化子防病效果明显优于67-1原始菌株和化学农药,通过实时荧光定量PCR验证,发现此3株工程菌株几丁质酶表达量明显增加。

地衣芽孢杆菌与粉红粘帚霉复配菌种对马铃薯疮痂病及产量的影响

目的探索地衣芽孢杆菌与粉红粘帚霉复配菌种对马铃薯疮痂病及产量的影响。方法以采自沽源县携带疮痂病的马铃薯病薯薯块为试验材料,研究不同菌量的地衣芽孢杆菌与粉红粘帚霉复配菌种对马铃薯疮痂病及产量的影响。结果不同处理的地衣芽孢杆菌和粉红粘帚霉复配菌种对马铃薯的产量几乎没有影响,但对马铃薯疮痂病的影响较大,与对照相比存在显著性差异;不同处理间对马铃薯疮痂病的影响差异不显著。结论地衣芽孢杆菌与粉红粘帚霉菌复配菌种不影响马铃薯产量,但可以有效地防治马铃薯疮痂病。

粉红粘帚霉67-1厚垣孢子形成与贮存研究

为研制粘帚霉生防制剂,以粉红粘帚霉67-1为材料,对粉红粘帚霉67-1厚垣孢子的生长过程、孢子结构、贮存介质和制剂含水量以及厚垣孢子和分生孢子的货架期比较进行了研究。结果表明:在特定的培养基中,粉红粘帚霉67-1在培养24h后产生厚垣孢子,厚垣孢子形成于菌丝顶端或中部,并可以脱落游离到培养基中。电镜下可以看到圆形或椭圆形厚垣孢子以及加厚的细胞壁。相同贮存条件下,厚垣孢子的货架期比分生孢子长。低温条件下,10%含水量的贮存介质更利于厚垣孢子的贮存。

粉红粘帚霉67-1液体发酵生产生物农药概述

对粘帚霉属真菌的生防资源和寄生机理进行了概述,从而明确了生防真菌粘帚霉的生理特性。在此基础上,对液体发酵工艺进行介绍,分析利用粉红粘帚霉67-1形成微生物农药生产线的可行性。

枯草芽孢杆菌与粉红粘帚霉复配防治马铃薯粉痂病试验

目的为了探索枯草芽孢杆菌与粉红粘帚霉复配菌剂对马铃薯粉痂病的防治效果。方法以沽源县2018年发生粉痂病的马铃薯为试验材料,将枯草芽孢杆菌和粉红粘帚霉复配与麦麸混合后,以不同菌剂量给供试马铃薯种薯薯块儿包衣。收获后测产并调查大、小薯数比例及粉痂病的病情指数。结果枯草芽孢杆菌和粉红粘帚霉复配菌剂,不影响马铃薯的出苗率,不影响马铃薯的大、小薯个数比例及产量。然而对马铃薯粉痂病病情指数的影响存在显著性差异。结论马铃薯种薯中拌入枯草芽孢杆菌和粉红粘帚霉复配菌剂,对马铃薯粉痂病有明显的防治效果,推荐在生产中应用。

粉红粘帚霉菌丝体化学成分研究

用柱层析色谱进行分离,光谱和化学方法进行结构鉴定,从一种明显促进花叶开唇兰Anoectochilus roxburghii (Wall.)Lindl.生长的粘帚霉属真菌——粉红粘帚霉Gliocladium roseum (Link) Bani.的菌丝体分离鉴定了1,3-二棕榈酰基-2-(4,4-二甲基庚二酸单酰基) 甘油酯(I),4,4-二甲基庚二酸(II)等4个化合物。其中,I为新化合物, II 为首次从本属分离得到的天然产物。

粉红粘帚霉的形态特征及分子生物学鉴定

粉红粘帚霉具有生长快、产孢量大、寄主范围广、寄生能力强、拮抗机制多等优点,是一种重要的生防菌,开展粉红粘帚霉对林果枝干病害的防治效果实验具有重要意义。实验室从苹果枝干发病部位分离获得一株粉红粘帚霉菌株,本文研究了该菌株的形态特征及分子生物学鉴定方法。

粉红粘帚霉G-019浅盘发酵工艺研究

为提高孢子产量,对粉红粘帚霉G-019浅盘发酵工艺进行了研究,开展了固态发酵基质和营养液成分的筛选以及含量的单因素试验。结果表明,最佳发酵工艺为:固态发酵基质为麸皮75%、玉米粉15%、啤酒糟10%,营养液为糖蜜2%、磷酸氢二钾0.15%、硫酸镁0.05%,料液比1∶1。在此条件下发酵10 d,孢子数可达1.07×1010CFU/g。

粘帚霉GR-6菌株种类鉴定及其β-1,3-葡聚糖酶纯化与酶学性质

为明确粘帚霉GR-6产生的β-1,3-葡聚糖酶对植物病原真菌的作用机制,建立β-1,3-葡聚糖酶分离纯化体系,根据形态特征和ITS序列分析鉴定GR-6种类,用60%饱和度的丙酮沉淀酶蛋白质,再通过DE-52离子交换层析和Sephadex G-75凝胶柱层析纯化蛋白质。结果表明,GR-6菌株ITS序列与粉红粘帚霉的相似度最高,达到98%,结合形态学特征将该菌株鉴定为粉红粘帚霉。SDS-PAGE显示纯化后得到一种分子量为4.11×104的蛋白质,该蛋白质具有β-1,3-葡聚糖酶活性。经该酶处理后的水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和棉花黄萎病菌(Verticilliun dahliae)菌丝颜色变浅、细胞轮廓变模糊、甚至菌丝细胞逐渐消失,可见,粉红粘帚霉GR-6产生的β-1,3-葡聚糖酶对这两种植物病原真菌菌丝有直接破坏作用。纯化后的β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为4,酶液在50℃以下或pH 5时保存0.5 h,酶活性基本保持稳定;该葡聚糖酶对一些金属离子较敏感,其中Zn2+、Sn2+、Ca2+、Fe2+等使酶活性显著降低,而Mn2+和K+对酶活性没有明显的影响。建立的β-1,3-葡聚糖酶纯化体系稳定可靠。