粉纹夜蛾颗粒体病毒增效基因3′端2.5kb片段在大肠杆菌中的表达

将粉纹夜蛾Trichoplusiani颗粒体病毒增效基因 3′端 2 5kb片段插入 pQE 31中构建了重组表达载体 pQE/enhancin ,转化大肠杆菌M 15( pREP4 )在IPTG诱导下成功表达出分子量约为96kD的融合蛋白并命名为P96。初步纯化的P96显示了明显的增效活性 ,可提高棉铃虫核型多角体病毒对棉铃虫 3龄幼虫感染死亡率 2 7 4 0 %～ 34 50 % ,缩短LT50 1

粉纹夜蛾颗粒体病毒重组增效蛋白的增效作用

采用时间 剂量 死亡率模型 ,分析了粉纹夜蛾 (Trichoplusiani)颗粒体病毒重组增效蛋白P96对棉铃虫 (Helicoverpaarmigera)核型多角体病毒 (HaNPV)感染棉铃虫幼虫的增效作用。结果显示 :感染后 11d ,HaNPV +P96组的LC50 值为 3.4 7× 10 3 多角体 /mL ,比HaNPV组 ( 3.89× 10 4 多角体 /mL)降低了 91.0 8% ;在 1.6× 10 4 ～ 1.6× 10 6多角体 /mL浓度范围内 ,HaNPV +P96组的LT50 值较HaNPV组缩短 0 .3～ 1.8d。

粉纹夜蛾细胞中Bt Cry1Ac选择抗性的研究及离体品系与毒素结合的比较

采用BtCry1Ac活性毒素对粉纹夜蛾BTI Tn 5B1细胞进行 5 6代筛选后获得了抗性比为 1 2 80倍的抗性细胞。ELISA检测表明抗性细胞总蛋白和膜蛋白结合的Cry1Ac数量都少于敏感细胞。配体结合Western杂交实验显示 :抗性细胞和敏感细胞的膜蛋白与总蛋白都有 5条电泳迁移率相同的毒素结合多肽带 ,其分子量分别为 2 0 7,1 5 8 5 ,1 1 8 8,72 ,3 8 5kD ;抗性细胞的 1 1 8 8和 72kD的阳性带比敏感细胞的略弱 。

粉纹夜蛾中肠微生物中产AHLs群体感应信号分子菌株的分离鉴定

利用紫色杆菌(Chromobacterium violaceum CV026)报告系统从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)中肠中分离出两株可以产群体感应信号分子的菌株Tni-9和Se-9。通过16S rDNA序列分析结果可知,分离菌株均与蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtiiATCC 43186)有高度同源性,在系统发育树内位于同一分支。选取菌株Se-9进行生理生化特性鉴定,进一步证实该菌株为蒙氏肠球菌。将菌株Se-9进行薄层层析分析,发现该菌株可以产生两种群体感应信号分子C6-HSL和3OC6-HSL。

抗苏云金杆菌毒素Cry1Ac粉纹夜蛾细胞系的特性研究

为了从离体细胞水平探讨昆虫对苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的部分抗性机制,本文采用活化的Cry1Ac 毒素对粉纹夜蛾BTI-TN-581-4细胞连续筛选86代,获得了高水平抗性细胞,研究了其某些特性。它对Cry1c 产生了低水平的交互抗性,对低渗溶液的耐受性显著增强,双向电泳图谱表明抗性细胞膜蛋白组分发生了明显的变化。膜蛋白组分的变化可能导致了筛选细胞的耐低渗透压和抗Cry1C。

粉纹夜蛾离体细胞抗菌肽的抗菌谱测定

用热灭活的大肠杆菌DH5α诱导粉纹夜蛾 (Trichoplusiani)离体细胞产生抗菌肽 ,用三氯乙酸沉淀法提取出该活性物质 ,采用琼脂糖孔穴扩散法和生长抑制测定法测定其抗菌谱 ,发现该抗菌物质具有较广的抗微生物活性 ,其中特别是对革兰氏阴性菌中的沙门氏菌和大肠杆菌 ,酵母菌中的白色念珠菌 ,植物病源真菌中的花生白绢病菌和小麦赤霉病菌具有较强的抑菌活性 ,从而表明该物质是一种既抗细菌 ,又抗真菌的抗微生物肽。

粉纹夜蛾颗粒体病毒全长增效基因在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术扩增了粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)颗粒体病毒增效基因全长片段,扩增产物用EcoRⅠ/HindⅢ双酶消化,经0.7%低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化后插入pRSET-B中,得重组表达质粒pRSET/enhancin;但重组子生长异常,在IPTG诱导下未能明显表达目标蛋白.用PstⅠ/HindⅢ双酶消化pRSET/enhancin,电泳回收2.7kb片段后插入pQE-30中,得重组表达载体pQE/enhancin;在IPTG诱导下于35℃成功表达出分子量(Mr)约为108×103的融合蛋白并命名为P108.初步纯化的P108显示了极显著的增效活性,对棉铃虫核型多角体病毒感染棉铃虫3龄幼虫的7d致死率提高34.03%,LT50缩短1.4d;对苏云金杆菌杀棉铃虫3龄幼虫的72h致死率提高65.96%.

Bt Cry1Ac抗性粉纹夜蛾离体细胞与敏感细胞mRNA的差异显示

为了研究昆虫对Bt的抗性机制 ,以苏云金芽孢杆菌Cry1Ac活性毒素对粉纹夜蛾离体细胞连续筛选 80代 ,获得了高抗性细胞。采用DDRT PCR技术比较了该抗性细胞与非选择敏感细胞mRNA的差异 ,经反向RNA斑点印迹杂交确证了 5个片段为两种细胞的显著差异表达序列标签(ESTs)。序列分析结果表明 ,敏感细胞特有的三种ESTs都位于cDNA的非编码区 ,两种ESTs(GenBank注册号 :S1 ,CF32 2 4 1 5 ;S3,CF32 2 4 1 7)与数据库中EST没有显著同源性 ,另一种S2(GenBank注册号 :CF32 2 4 1 6)与已登录的某些昆虫的ESTs具有一定的同源性。从抗性细胞特有的R1 (GenBank注册号 :CF32 2 4 1 3)推导出的氨基酸序列与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶有 60 %～63%的同源性 ,从抗性细胞特有的R2 (GenBank注册号 :CF32 2 4 1 4)推导出的氨基酸序列与黏蛋白类有约 30 %的同源性。这些差异表达基因可能与抗性的形成相关。

粉纹夜蛾离体细胞抗菌肽的诱导和抗菌活性测定

以每细胞1 000 个灭活的大肠杆菌诱导粉纹夜蛾传代细胞,诱导细胞的上清液经三氯醋酸沉淀提取诱导蛋白,抗菌活性用液体培养抑制测定法进行检测.试验证明:细胞诱导后第8 h开始产生抗菌物质,第12 h 达最高峰;提取的抗菌物质经100℃处理4 h,仍然保持抗菌活性.

用单细胞凝胶电泳技术检测粉纹夜蛾5BI细胞DNA损伤的研究

为了探测昆虫细胞的 DNA损伤 ,本实验应用单细胞凝胶电泳技术 ,对不同剂量的过氧化氢和甲醛引起的粉纹夜蛾 5 BI细胞 DNA损伤效应进行了研究 ,结果表明 5 0 μM、10 0 μM、15 0 μM的过氧化氢能引起粉纹夜蛾 5 BI细胞的 DNA断裂 ,且断裂程度和浓度水平之间成正相关关系 ;10 μM、30 μM、5 0 μM的甲醛能引起粉纹夜蛾 5 BI细胞 DNA损伤 ,其中在 10μM时引起 DNA断裂 ,在 30μM、5 0μM时引起 DNA交联。

粉纹夜蛾类Cry1Ac受体氨肽酶NcDNA片段的克隆与分析

设计简并引物 ,采用RT PCR方法对粉纹夜蛾Trichoplusiani(H櫣ｂｎｅｒ)细胞系BTI TN 5B1 4的氨肽酶N(aminopeptidaseN ,APN)基因cDNA片段进行了克隆和序列分析 ,通过两对引物扩增出了两种氨肽酶N基因的cDNA片段 ,大小分别为 188bp和5 6 4bp ,分别命名为AS188(GenBank登录号 :CD80 932 4 )和AS5 6 4 (GenBank登录号 :CD80 932 6 )。对这两个片段推导的氨基酸序列进行同源性分析 。

粉纹夜蛾细胞系QB-Tn9-4s的克隆以及克隆株生物学特性的研究

对粉纹夜蛾Trichoplusiani细胞系QB-Tn9-4s进行细胞克隆,获得了8个细胞克隆株,分别命名为QB-Tn-A、B、C、D、E、F、G和H。对基因组DNA进行RAPD-PCR鉴定,各细胞克隆株与原始细胞系具有相同的DNA扩增谱带。各细胞克隆株在形态和生物学特性方面表现出一定的差异。克隆株QB-Tn-A、B、C、D和E以梭形细胞为主,大约占细胞总数的60%～80%;F、G和H以棒状细胞为主,比例分别为44.5%、49.5%和80.0%。8个克隆株对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)均较敏感,感染率均在92%以上,平均每个细胞病毒多角体(OBs)产量在78～110个之间,其中克隆株QB-Tn-A多角体产量最高达110个,略高于BTI-Tn5B1-4和QB-Tn9-4s,明显高于Sf-9细胞;克隆株QB-Tn-E、H、A和C的出芽性病毒(BV)产量与原始细胞系(3.37×107TCID50/mL)接近,而其它4株均低于原始细胞系。

粉纹夜蛾传代细胞的分泌特性研究

粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)传代细胞系BTI-Tn5BI(简称5BI)在大肠杆菌的诱导下能够产生抗菌肽。通过电生理技术检测了5BI细胞分泌抗菌肽的分泌特性。实验表明:粉纹夜蛾传代细胞具有一定的可兴奋性,能够在瞬时细胞内钙浓度升高的刺激下产生分泌,且分泌的动力学特征可用双指数拟合,证明其分泌的钙依赖性。

粉纹夜蛾5BI细胞的悬浮培养

报道了粉纹夜蛾５ＢＩ细胞在转瓶系统悬浮培养及血清浓度、细胞接种浓度、非离子表面活性剂ＰｌｕｒｎｉｃＦ－６８等对细胞生长的影响与作用．实验结果显示：５ＢＩ细胞能够在搅拌条件下，在含５％血清培养基中正常生长增殖，当血清浓度降至２％时，细胞生长速率产生较明显变化；ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８对细胞生长有显著的保护作用．

花木害虫粉纹夜蛾抗生物农药Bt抗性机制的研究进展

苏云金芽孢杆菌（Bt）产生的伴孢晶体蛋白（Cry毒素）具杀虫活性,对昆虫有高度选择性而对人畜无害,已开发成生物农药广泛使用。随着Bt农药全世界大量,应用,部分昆虫产生了抗药性。粉纹夜蛾在我国广泛分布且危害较大,已发现其对Bt农药和转Bt基因植物产生抗性。本文比较粉纹夜蛾抗Bt毒素细胞与敏感细胞的各项差异,应用蛋白组学和mRNA组学的方法技术,分析发现敏感细胞与抗性细胞的大部分差异蛋白,都与糖蛋白、胞质结合蛋白、脂蛋白、脂多糖蛋白相关,提示昆虫对Bt抗性的形成可能与膜蛋白有关。

粉纹夜蛾核型多角体病毒p35基因的克隆与序列分析

粉纹夜蛾核型多角体病毒ｐ３５基因的克隆与序列分析施宪宗１王王旬章龙綮新２代小江曲士芮陈曲侯１庞义（中山大学生物防治国家重点实验室，广州５１０２７５）关键词ＴｎＮＰＶｐ３５基因，序列分析，细胞凋亡目前所知，杆状病毒编码两种阻遏宿主细胞因病毒感染而诱发细...

一种适合粉纹夜蛾5B1细胞生长的无血清培养基的研究

报道了一种适合粉纹夜蛾 ( 5B1 )细胞生长的无血清培养基 (简称为 SFM) .该培养基以 Tc-1 0 0基础培养基为基础 ,补加一定量的水解乳蛋白和酵母抽提物 ,并加入适量的微量元素、维生素、脂类复合物等 ,5B1细胞已在该 SFM中传代 1 8代 ,研究结果表明 :该培养基能支持 5B1细胞的生长和芹菜夜蛾核型多角体病毒 ( Sfa MNPV)

粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)培养细胞对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的吞噬过程观察

观察微孢子虫在非天然宿主细胞系的生物行为过程,有助于探究微孢子虫的侵染特异性机制。选用鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni,Tn)细胞系为材料,接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)孢子后观察其吞噬过程。结果发现:经氢氧化钾发芽预处理的Nb孢子虽然可以在Tn培养细胞液中发芽,但未见发芽孢子的孢原质进入Tn培养细胞;在接种Nb孢子浓度为2.0×105mL-1以上时,观察到孢子通过内吞作用进入了Tn培养细胞,但未见孢子的增殖;随着时间的延长和进入Tn培养细胞的Nb孢子的增加,可引起Tn培养细胞的超微结构变化,并导致细胞的裂解。以上结果说明,虽未见Nb以发芽形式感染Tn培养细胞,但Nb能够被吞噬进入Tn培养细胞并破坏其结构。