粉被虫草N^6-(2-羟乙基)腺苷高产菌株的原生质体诱变育种

在粉被虫草（CordycepspruinosaPetch）无性型─-粉被马利娅霉（MariannaeaPruinosaLiang）原生质体形成和再生的前期研究基础上，报道了通过原生质体诱变培育高产N6－（2－羟乙基）腺苷菌株的研究结果。粉被马利娅霉Cp－14单孢子株经15W紫外灯照射后，获得一高产突变株MpM－135。经多代移植后，此突变株比出发菌株Cp－14的N6－（2－羟乙基）腺苷含量提高了14．8％。实验还表明，粉被虫草无性型菌丝提取物对枯草杆菌（Bacillussubtilis）抗紫外辐射效果与菌丝所含N6－（2－羟乙基）腺苷含量有正相关性。

粉被虫草抑制细菌和真菌作用的初步研究

对粉被虫草的无性型－粉被马利亚霉抑制细菌和真菌作用进行了初步研究。结果表明，粉被马利亚霉菌丝体和孢梗束的浸提液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌及嗜热芽胞杆菌有明显抑制作用，不同的处理、提取、药敏试验方法，所表现出的抗菌活性有所差异。

3种植物激素对粉被虫草子实体形成的影响

按照正交设计方案在固体培养基中加入3种不同浓度的植物激素,对粉被虫草子实体的形成进行了初步研究。结果表明,不同激素组合的处理均获得了大量的子实体,但是因素和水平的显著性随着指标选择的不同而有所差异。5-羟基吲哚乙酸(IAA)对于子实体的及早生成、环磷腺苷(cAMP)对鲜重、以及植物激动素(KT)对干重均有显著影响,而3种激素对子实体的数量(生长点数)均无显著影响。

粉被虫草菌丝体多糖的分离纯化及其性质

粉被虫草菌丝体经沸水浸提、醇析、透析、Ｓｅｖａｇｅ法脱蛋白、再经ＤＥＡＥ－纤维素和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱层析纯化，得菌丝体纯多糖ｐｓ１和ｐｓ２．高效液相色谱（ＨＰＬＣ）检测ｐｓ１和ｐｓ２均为单一物质；凝胶过滤法测得ｐｓ１和ｐｓ２的分子量分别为２４０００和１３０００Ｄａｌ．气相色谱分析表明ｐｓ１的单糖组分有Ｄ－甘露糖、Ｄ－葡萄糖和Ｄ－半乳糖，ｐｓ２的单糖组分有Ｄ－甘露糖和Ｄ－葡萄糖．ＩＲ分析表明ｐｓ１和ｐｓ２均有多糖特征吸收峰并存在α－糖苷键．

粉被虫草液体培养条件的优化

通过摇瓶液体培养正交试验获得了粉被虫草的液体培养条件,即蔗糖2.5%,马铃薯淀粉2%,黄豆0.5%,牛肉膏0.5%,酵母膏0.1%,K2HPO4 0.1%,KCl 0.02%,MgSO4·7H2O 0.05%,pH5～7,装液量(100ml/250ml摇瓶),加15颗玻璃珠作分散剂,5%接种量,旋转式摇床150r/min,28℃培养7d,达到最大菌丝干重31.86g/L,于9d获得最大胞内产物3.13g/L。同时,对摇瓶液体培养和生物反应器液体深层分批培养的动力学做了较系统的研究,无论生物反应器还是摇瓶,其培养过程中相对应的pH、残糖、氨基氮、菌丝干重、胞内产物等参数变化趋势基本一致,但生物反应器培养时间大大缩短,48h即可达到最大菌丝干重29.97g/L,54h达到4.95g/L的最高胞内产物产率。生物反应器设定培养温度28℃、装液量65%、接种量10%、0.2%的消泡剂、搅拌转速350r/min、通气量(12±3)L/min、罐压1.1MPa、初始pH6.5,培养基配方用食用蔗糖3%、蔗糖糖蜜2%、花生0.5%分别替代蔗糖、马铃薯淀粉、牛肉膏以降低成本。实验表明,粉被虫草的液体培养条件基本能达到工业发酵水平的要求。

粉被虫草(Cordyceps pruinosa Petch)无性型对苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis subsp.galleria Heimpel)抗紫外辐射的保护效应

本文首次报道了粉被虫草的无性型粉被马利娅霉(Mariannaea PruinosaLiang)对苏云金杆菌抗紫外辐射的保护作用,建立了粉被马利娅霉抗紫外辐射物质的苏云金杆菌检测法。用粉被马利娅霉的培养液、菌丝体浸提液及孢梗束浸提液所培养的苏云金杆菌经紫外辐射后,活菌数依次比对照提高26.3％、138.6％、187.8％。揭示了抗辐射物质的含量是孢梗束高,菌丝体次之,培养液最低的趋势。不同来源的粉被马利娅霉菌株抗紫外辐射物质的含量是有差异的。

粉被玛利亚霉中天然色素的高速逆流色谱法分离制备及质谱分析

采用高速逆流色谱法分离制备粉被玛利亚霉菌丝体甲醇提取物中的天然色素。溶剂体系为V(乙酸乙酯):V(正丁醇):V(甲醇):V(水)=10:3:3:10,以其下相为流动相,上相为固定相,转速850 r/min,流速为2mL/min,紫外检测波长340 nm。所得色素产物的纯度经高效液相色谱分析为95.3%(峰面积归一化法),其分子式由高分辨ESI-MS确认为C26H32O9。经天然产物数据库查询,没有发现与该分子式匹配的化合物,因此该色素可能为一新化合物。

戴氏虫草和粉被虫草多糖对巨噬细胞等活性的影响

目的研究虫草属新种 -戴氏虫草菌丝体胞外水溶性多糖 (CDP1)和粉被虫草菌丝体多糖 (CPP1)在体外对小鼠腹腔巨噬细胞 (MΦ)吞噬功能和脾细胞免疫功能的影响。方法 MTT比色法测定淋巴细胞增殖 ,孔雀绿比色法测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能 ,中性红比色法测定细胞毒淋巴细胞 (CTL)活性。结果 CDP1在正常情况下不能促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能 ,而 CPP1却有促进作用 ;在免疫抑制的情况下 ,一定浓度的戴氏虫草菌丝体胞外水溶性多糖和粉被虫草多糖能恢复提高吞噬功能。它们不仅能促进正常脾活化 T淋巴细胞的增殖 ,而且能恢复环磷酰胺和氢化可的松抑制免疫小鼠脾活化 T淋巴细胞的增殖。在合适的浓度下能增高小鼠脾 CTL 活性 ,同时在一定浓度下能恢复免疫抑制小鼠脾 CTL 活性。结论两者具有增强免疫功能的作用。

粉被马利娅霉原生质体的形成与再生

本文报道几个影响粉被马利娅霉（ＭａｒｉａｎｎａｅａｐｒｕｉｎｏｓａＬｉａｎｇ）原生质体形成和再生的重要因子。在所试的几种酶中，以单用蜗牛酶（Ｓｎａｉｌａｓｅ）６～８ｍｇ／ｍｌ于２５℃处理３～４ｈ对原生质体的制备和再生效果都较好。原生质体的形成与再生对０．６ｍｏｌ／Ｌ的三种无机盐稳定剂无选择性，均为合适的渗透压稳定剂。巯基乙醇对于原生质体的形成不是关键因素。打散菌丝时的机械拉力强度也很大程度上影响原生质体的形成。

粉被虫草氯仿部分化学成分研究

用液体静置发酵的方式培养粉被虫草菌丝体,用75%酒精提取,利用萃取、柱层析、结晶、重结晶等方法,对粉被虫草菌丝体的化学成分进行了分离、纯化,采用核磁等手段进行结构鉴定。结果从粉被虫草氯仿部分分离出5个物质,将其中3个物质鉴定为胆固醇、β-谷甾醇和虫草酸,这3种化合物均为首次从粉被虫草中分离得到。研究将为这些化合物提供新的生物来源,为粉被虫草的深度开发利用提供科学参考。

戴氏虫草和粉被虫草菌丝体发酵液对放射损伤小鼠体液免疫的影响

以６０Ｃｏ γ射线放射损伤小鼠为动物模型，采用溶血素测定（ＨＣ５０） 比色法测定戴氏虫草和粉被虫草菌丝体发酵液对γ射线辐射损伤小鼠的血清溶血素水平等的影响，同时测定小鼠脾指数和体重的变化。结果表明：在所试剂量条件下，戴氏虫草菌丝体发酵液可以降低γ射线辐射损伤小鼠血清溶血素的水平，但是不影响脾指数；而在一定剂量条件下，粉被虫草菌丝体发酵液可以恢复提高γ射线辐射损伤小鼠血清溶血素的水平，同时也能够恢复提高脾指数。

粉被虫草无性型单孢子株间和单孢子株内的营养亲和性

在含5％氨酸钾的KMM和KPS培养基上,粉被虫草无性型以3种途径产生不利用硝酸盐的突变株（nit突变株）。（1）由菌落基质菌丝形成的快速生长气生菌丝角变;（2）菌落表面快速生长的气生菌丝;（3）菌落基质菌丝缓慢生长形成的基质菌丝角变。来自18个单孢子株的94个nit突变株中,64.8％的突变株是稳定的。配对试验结果表明:在全部19个配对中,单孢子株内配对率为57.9％,单孢子株间配对率为42.1％。在全部nit突变株中,Cp-14c3突变株与其它突变株间的配对率最高（18.2％）。单孢子株间配对率高的孢子株是Cp-14Cp-7,Cp-5和Cp-6,将来自Cp-14同一单孢子株的Cpe-14C3分别与Cp-14cl和Cp-14c4nit突变株配对后发现,它们形成的浓密生长配接线的颜色是不相同的,前者橙色,后者白色。统计结果发现,所试全部的单泡子株可分成11个营养亲和群（VCGs）,那些含有易与其它菌株配对的nit突变株的单孢子株,如Cp-1,Cg-4,Cp-5,Cp-6,Cp-7,Cp-13,和Cp-14等皆在同一营养亲和群内。用Hochest33258荧光染色观察发现,野生型菌株的菌丝和分生孢子单核,nit突变株的少量分生孢子中可见双核,互补配对形成的浓密菌丝丛中的分生孢子则常见双核。

粉被虫草提取物对巨噬细胞吞噬功能及CTL活性的影响

研究粉被虫草菌丝体提取物在体外对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和脾细胞免疫功能的影响，结果表明：粉被虫草提取物在正常情况下不仅能够促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，而在免疫抑制的情况下，一定浓度的粉被虫草菌丝体提取物还能恢复提高吞噬功能；它不仅能促进正常脾活化Ｔ细胞的增殖，而且能恢复环磷酰胺和氢化可的松抑制免疫小鼠脾活化Ｔ细胞的增殖；在较高浓度下能增高小鼠脾细胞毒Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）活性，同时在一定浓度下能恢复免疫抑制小鼠脾ＣＴＬ活性。

粉被虫草提取物抗癌作用初步研究

研究粉被虫草乙酸乙酯提取物和水提取物的体外抗肿瘤作用.人工发酵培养粉被虫草菌丝体,采用MTT和SRB法观察粉被虫草乙酸乙酯提取物、水提取物对人肝癌细胞株BEL-7402、人结肠癌细胞株COLO205的抑制作用.结果表明:粉被虫草水提取物对人结肠癌细胞COLO205抑制作用不显著,粉被虫草乙酸乙酯提取物对BEL-7402细胞抑制作用不显著.

粉被虫草乙酸乙酯部化学成分研究

用液体静置发酵的方式培养粉被虫草菌丝体,用75%酒精提取,利用萃取、柱层析、结晶、重结晶等方法,对粉被虫草菌丝体的化学成分进行了分离、纯化,采用核磁等手段对分离到的物质进行鉴定。结果从粉被虫草乙酸乙酯部分分离出6个物质,将其中2个鉴定为腺嘌呤、尿苷,均为首次从粉被虫草中分离得到。

粉被马利娅霉(Marianaea pruinosa)对苏云金杆菌抗紫外线辐射的保护效应

本文首次报道了粉被虫草的无性型粉被马利娅霉(Marianaea pruinosa Liang)对苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis subsp. galleria Hermpel)的抗紫外辐射的保护作用,建立了粉被马利娅霉抗紫外辐射物质的苏云金杆菌检测法。用粉被马利娅霉的培养液,菌丝体浸提液及孢梗束浸提液所培养的苏云金杆菌经紫外辐射后,活菌数依次比对照提高26.3％,138.6％和187.8％,揭示了抗辐射物质的含量是梗孢束高,菌丝体次之。培养液最低的趋势,主要为胞内产物。不同来源的粉被马利娅霉菌株抗紫外辐射物质的含量是有差异的。

粉被虫草抗紫外线及对巨噬细胞吞噬功能影响的初步研究

目的:研究粉被虫草抗紫外线及对巨噬细胞吞噬功能的影响。方法:采用孔雀绿比色法测定粉被虫草菌丝体水提物在体外对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。同时采用紫外线辐射的方法测定其对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌抗紫外线辐射的保护效应。结果:粉被虫草菌丝体水提物在较高浓度下能够抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,但在较低浓度下却能拮抗氢化可的松对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的抑制;对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌抗紫外线辐射具有一定的保护效应。结论:粉被虫草菌丝体水提物能调节巨噬细胞吞噬功能和抗紫外线辐射。

人工培养粉被虫草菌丝体和孢梗束的代谢组差异

目的探讨人工培养的粉被虫草菌丝体和孢梗束的代谢物差异。方法利用高效液相色谱-飞行时间质谱(High performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry,HPLC-TOF-MS)对人工培养的粉被虫草菌丝体和孢梗束进行代谢物数据采集,所得数据采用正交偏最小二乘判别法(Orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)进行分析,筛选出他们之间的差异化合物。结果人工培养的粉被虫草菌丝体和孢梗束的代谢产物差异显著,经谱库检索和筛选分析,得出58个差异化合物。结论人工培养的粉被虫草菌丝体和孢梗束代谢组差异显著,前者含有较多营养物质,后者含有较多生物活性代谢物,孢梗束具有较大的药用开发潜力。