粒-单细胞集落刺激因子在血液病治疗中的应用

粒-单细胞集落刺激因子(下简称GM-CSF)主要是由单核、巨噬细胞,血管内皮细胞,纤维母细胞.骨髓间质细胞及粒细胞产生的一种糖蛋白激素.对血液系统有广泛的作用.主要作用于骨髓的早期多能于细胞,促进粒细胞的生长发育,而且对巨噬细胞的生长是必须的,因而对于血液病的研究与治疗有密切关系.下面就其生理功能.临床应用,有争议的问题及副作用综述如下.

粒-单细胞集落刺激因子的研究进展

本文综述了近年来对粒－单细胞集落刺激因子的研究进展，主要阐述了其生理功能、临床应用及有争议的问题。

胎盘血中粒单细胞集落刺激因子含量测定分析

目的 :探讨 GM- CSF在胎盘血中含量及临床意义。方法 :采用 EL ISA法对照检测健康妇女、孕妇和胎盘血 GM-CSF中含量。结果 :胎盘血和孕妇血中含量高于健康妇女血 (P <0 .0 1)。结论 :胎盘血中有丰富的造血细胞因子 ,用于治疗化放疗引起的骨髓抑制有实用价值。

▽5-人粒系集落刺激因子(▽5-hG-CSF)的cDNA克隆、序列测定与表达

从LPS刺激的正常中国人外周血单核细胞中提取mRNA,经反转录(RT)-PCR扩增出不含信号肽和成熟型N端5氨基酸(V5-hG-CSF)的cDNA片段,酶切后组入大肠杆菌表达载体pJLA602中。序列测定表明,克隆片段与国外报道的高活性hG-CSF cDNA序列一致。重组子经诱导表达、小鼠骨髓细胞体外CFU-G测试表明,表达产物具明显的粒细胞集落刺激活性。

逆转录病毒介导转导的人粒-巨噬系集落刺激因子基因在哺乳动物细胞中的表达(英文)

利用多聚酶链反应(PCR)方法,从活化的人外周血单个核细胞中克隆了人粒-巨噬系集落刺激因子(GM-CSF)的cDNA。DNA序列测定证实此片段为完整的GM-CSF cDNA。应用DNA重组技术,将此cDNA重组于逆转录病毒载体pDORneo上,以Lipofectin介导转染病毒包装细胞PA317,用NIH3T3细胞测定病毒滴度。选取高滴度病毒上清感染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经G418筛选获抗性克隆,PCR方法鉴定重组载体整合于CHO细胞的基因组DNA中。用CFU-GM集落形成实验检测GM-CSF活性,证实转染后的CHO细胞有GM-CSF的稳定、高效表达。

人粒系集落刺激因子(hG-CSF)cDNA于P_RP_L启动子作用下在大肠杆菌中的表达

hG—CSF cDNA在天然状态下很难在大肠杆菌中表达。本文以作者克隆的高活性形式hG—CSF cDNA为模板,经PCR扩增出含hG—CSF信号肽中丙氨酸(Ala)及成熟型全部氨基酸编码序列的cDNA片段,于NcoⅠ、BamHⅠ位点克隆于原核表达载体PJLA602中,用高活性hG—CSF特异探针菌落原位杂交筛选出阳性克隆。此克隆hG—CSF cDNA在λ噬菌体 P_RP_L串联启动子和大肠杆菌atpE翻译起始区(TIR)共同作用下,阳性菌株热诱导表达后经小鼠骨髓细胞体外CFU-G测试表明,表达产物具明显的粒细胞集落刺激活性。

巴西蘑菇多糖对造血干、祖细胞生成的影响

目的:探讨国产巴西蘑菇多糖对造血干、祖细胞生成的影响及其作用机制。方法:应用造血细胞培养技术、流式细胞仪(FACS)、逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)观察药物对小鼠骨髓细胞及人脐血单个核细胞的影响。结果:经过巴西蘑菇多糖处理的动物,造血干细胞(CFU-S)、粒-单祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFU-E)和纤维母细胞(CFU-F)各组数值明显上升,与对照组比较,P均<0.01;FACS检测显示,实验组CD33+细胞明显上升,在诱导的d 7达高峰;经RT-PCR检测结果表明,巴西蘑菇多糖诱导人脐血单个核细胞48 h后,粒单细胞克隆刺激因子(GM-CSF)mRNA的表达量是对照组的2.72倍。结论:巴西蘑菇多糖可促进造血干、祖细胞生成并可促进人脐血单个核细胞GM-CSF基因表达。

hGM-CSF基因穿梭表达载体的构建及其在鱼腥藻7120中的克隆

人粒—巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)作为一种造血生长因子,能够刺激T细胞和巨噬细胞增殖、成熟和分化,具有极其重要的免疫调解功能。本研究运用PCR方法,从质粒pAG-MT-8中克隆该基因,并在其5′端添加有利于在蓝藻细胞中高效表达的SD序列,然后插入到表达载体(pRL-439)强启动子PpsbA的下游,进一步与穿梭表达载体pDC-08相连构建成穿梭表达载体pDC-GM。利用三亲接合转移方法将该穿梭表达载体(pDC-GM)转入丝状鱼腥藻7120,通过相应抗生素筛选后得到能稳定遗传的转基因藻。以该转基因藻的基因组DNA为模板进行PCR检测,结果表明hGM-CSF基因已转入鱼腥藻7120。这是首次尝试把蓝藻作为制备重组hGM-CSF的新宿主,具有潜在的经济价值和社会效益。

人G-CSF基因组基因的克隆和序列测定

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种定向作用于粒系祖细胞的造血生长因子,它能特异性地刺激和调节粒细胞系统的增殖、分化、存活和活化,对治疗各种原因引起的粒细胞减少症具有显著疗效。许多研究者对G-CSF cDNA在大肠杆菌和其它表达系统中进行了研究,但应用G-CSF基因组基因所做的有关表达方面的研究为数不多。本研究利用PCR技术。

人脐血来源的树突状细胞体外培养、扩增及鉴定

目的 探讨人脐血来源的树突状细胞(dendritie cells,DC)的体外培养、增殖情况。方法 无菌条件下常规采集脐血,用密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞,贴壁培养2小时,去除非贴壁细胞,将获得的单个核细胞分为两组,试验组在含有粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)+白介素-4(IL-4)+肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的培养液中培养,在体外诱导分化为DC,对照组不加上述细胞因子。在DC发育过程中,在光镜下连续观察DC生长情况,流式细胞仪(FACS Calibur.BD公司)检测细胞表型。结果 正常体外培养的DC在第四天由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞,随着培养时间的延长,此类细胞数量增多,第八天为形态不规则的毛刺状并聚集成簇,为典型DC形态。FACS显示培养成熟的细胞高表达DC相对特异性标志CD1a,共刺激分子CD80、黏附分子CD54、高表达MHCⅡ类分子,提示DC提高共刺激功能和黏附功能。结论 人脐血经GM-CSF(50ng/ml)+IL-4(10ng/ml)+TNF-α(50ng/ml)体外培养,能诱导出成熟DC。

重组hGM-CSF乳酸链球菌的构建及初步验证

目的运用基因克隆技术将自行合成的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)转化于乳酸链球菌,并筛选获得高表达重组hGM-CSF的乳酸链球菌稳定株。方法将经过优化适合在乳链菌表达的hGM-CSF基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽、终止密码子的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF,然后将pNCSF进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,获得乳链菌表达载体pTRCSF,通过电穿孔转化于乳链菌,并通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳验证hGM-CSF的表达。结果获得了重组质粒pNCSF并经酶切鉴定和测序证实,酶切鉴定显示构建乳链菌表达载体pTRCSF及重组hGM-CSF乳链菌成功,蛋白电泳初步验证获得了高表达重组hGM-CSF的乳链菌株LL-CSF。结论运用基因克隆技术成功构建了重组乳酸链球菌LL-CSF,为进一步研究重组hGM-CSF的生物学特性及评价其潜在临床应用价值打下了基础。

孕妇血中GM-CSF、IL-2和IL-6的含量和意义

目的 :探讨 GM- CSF、IL- 2和 IL- 6在孕妇血中的含量及临床意义。方法 :采用 EL ISA法检测健康妇女和孕妇血中 GM- CSF、IL- 2和 IL- 6含量进行对比。结果 :孕妇血中 3种因子含量高于健康妇女 ,差异有显著意义(P<0 .0 1)。结论 :孕妇血中 GM- CSF、 IL - 2和 IL - 6含量显著增加 。

孕妇血中GM-CSF、IL-2和IL-6的含量及临床意义

目的探讨 GM- CSF、IL- 2和 IL- 6在孕妇血中含量及其临床意义。方法采用 EL ISA法检测健康妇女和孕妇血中 GM- CSF、IL- 2和 IL- 6含量。结果孕妇血中 3种因子含量高于健康妇女 (P<0 .0 1)。结论孕妇血中 GM- CSF、 IL- 2和 IL- 6含量显著增加 。

乳链菌表达hGM-CSF基因的拼装及其载体pNCSF构建

目的体外拼装适合在乳酸链球菌表达的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,hGM-CSF),并构建载体pNCSF。方法根据hGM-CSF的氨基酸序列及乳酸链球菌偏好的密码子,将hGM-CSF基因外显子的全长碱基序列用DNAWORKS程序设计成16条互补的寡核苷酸片段,并且分别在第1条和第16条寡核苷酸片段上分别设计PstⅠ和BamHⅠ酶切位点,将相同终浓度的寡核苷酸混合进行PCR反应,完成hGM-CSF基因拼接,得到目的基因片段,对寡核苷酸片段进行拼装和扩增,产物稀释后进一步纯化扩增,在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T,然后TA克隆于pGEMTeasy载体中,经酶切鉴定得到阳性克隆并经测序验证。然后亚克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000载体。结果通过PCR得到420左右目的DNA片段,获得了hGM-CSF和pNCSF阳性克隆,其DNA测序结果与设计序列完全一致。结论运用基因拼装及克隆技术成功拼装了hGM-CSF基因及构建了载体pNCSF,为乳酸链球菌表达重组hGM-CSF奠定了基础。

GM-CSF受体在白血病中的表达及意义

目的：了解 GM-CSF受体 (CD116)在急性白血病中的表达及其临床意义。方法：对 114例急性白血病患者进行免疫表型、细胞遗传学分析。结果： CD116在 ALL中无阳性表达，而在 AML中表达率为 42. 4％， CD116在 FAB各亚型间的出现频率存在明显差异， M5中阳性率最高为 83. 3％， M4为 40％， M3、 M2分别为 27. 2％、 15. 0％。 CD116＋ AML中未见特异性染色体异常，但 M5患者 2例出现＋ 8异常，均在 CD116＋组。结论： CD116主要表达在髓系白血病，且与具有单核细胞特征的白血病相关， CD116、 CD4联合染色体＋ 8有利于 M5亚型的诊断。

复方甲亢片对Graves病大鼠血清GM-CSF和溶菌酶的影响

目的:研究复方甲亢片对Graves病(GD)大鼠血清GM-CSF和溶菌酶的影响。方法:小肠结肠炎耶尔森氏菌种尾静脉免疫注射建立Graves病大鼠模型。随机分为正常组、模型组、复方甲亢片组、中药组、他巴唑组。灌胃治疗30天后,取外周血,ELISA法测定血清GM-CSF,比浊法测定血清溶菌酶。结果:各组大鼠之间血清GM-CSF水平无显著性差异(P>0.05)。复方甲亢片组以及中药组大鼠血清溶菌酶水平与他巴唑组比较有显著性差异(P<0.01),他巴唑组大鼠血清溶菌酶较模型组增高,有显著性差异(P<0.01)。结论:复方甲亢片中的中药组分对GD大鼠白细胞的保护作用可能是通过防止白细胞的破坏实现的。

树突状细胞对肿瘤细胞株的直接杀伤活性

目的 对比分析干扰素 γ(Interferon γ ,IFN γ)或脂多糖 (lipoplysaccharide ,LPS)刺激后的树突状细胞 (dendriticcell,DC)对肿瘤细胞杀伤活性的差异。方法 分离健康供者外周血单核细胞 ,用粒单细胞集落刺激因子和白介素 4诱导为DC。于培养液中加入LPS或IFN γ培养 12h ,作为LPS激活的DC(LPS DC)及IFN γ激活的DC(IFN DC)。用流式细胞仪检测DC表面共刺激分子的改变 ,以明确LPS或IFN γ对DC的不同刺激作用 ;同时 ,以恶性血液病细胞株HL 6 0、Jurkat及Daudi为靶细胞 ,用不同效靶比与DC共同培养 18h ,采用51Cr释放试验检测LPS DC及IFN DC抗肿瘤活性的差异。结果 ①LPS及IFN γ可不同程度的上调DC表面CD86、CD80、CD83及CD1a的表达 ,以LPS刺激组明显。②IFN γ和LPS可分别增强DC对HL6 0及Daudi的杀伤活性 ,在效靶比为 2 0∶1及 10∶1时杀伤率与未加刺激因子对照组 (medium DC)相比差异有显著意义 (P <0 0 5 )。相反 ,IFN γ DC对Daudi、LPS DC对HL 6 0无明显杀伤活性 ,但两者对Jurkat均具杀伤作用。结论 LPS及IFN γ激活的DC对肿瘤细胞的杀伤活性具有相对肿瘤特异性。