南方春大豆春、秋播与籽粒蛋白质脂肪含量关系的研究

以２４ 个南方春大豆品种（系）为材料，进行春、秋播研究不同播季对籽粒蛋白质、脂肪，以及蛋白质、脂肪合计含量的影响，结果表明：播季间蛋白质、脂肪，以及蛋白质、脂肪合计含量均达１％ 的差异显著水平；蛋白质含量与出苗至开花期日均温、最高温和最低温均呈极显著正相关，与开花至成熟期日均温、最高温和最低温呈显著或极显著负相关，脂肪含量则恰好与之相反，因此，湖南秋播的气候条件有利蛋白质的形成，故蛋白质含量比春播高，春播的气候条件则有利脂肪的形成，所以脂肪含量比秋播高；秋播各品种蛋白质、脂肪合计含量平均５９．９６％ ，比春播降低三点零八个百分点。

干细胞脑内移植有效标记研究:绿色荧光蛋白质粒标记的应用价值

目的:观察绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)质粒转化小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESC)的效果,以及将转化的胚胎干细胞移植入正常大鼠纹状体后,GFP质粒作为细胞存活情况示踪剂的效果。方法:首先利用感受态大肠杆菌提取大量高纯度GFP质粒DNA,然后将GFP质粒与脂质体孵育形成的转化复合物和小鼠胚胎干细胞共同孵育,使GFP质粒转入胚胎干细胞;筛选表达GFP的胚胎干细胞。将筛选后表达GFP的ESC移植入活体大鼠纹状体内,移植21d后,观察表达绿色荧光蛋白的移植细胞的存活情况。结果:GFP质粒转化以后的ES细胞团和单细胞都表达亮绿色的GFP,细胞打散计数证实大约60%的细胞携带GFP,移植21d后,大鼠脑内可见大量表达GFP的移植细胞。结论:脂质体可以将GFP质粒转入鼠的胚胎干细胞,携带有GFP的ES移植后21d,GFP可以作为示踪剂观察移植细胞的存活状况。脂质体辅助的GFP质粒转化胚胎干细胞是移植示踪的较好方法。

Hep G2细胞中乙肝病毒衣壳包裹绿色荧光蛋白质粒表达的研究

目的:观察乙型肝炎病毒衣壳(hep-atitis B virus envelope,HBVE)包裹绿色荧光蛋白质粒在肝癌细胞株(Hep G2细胞)中的表达效果是否优于脂质体包裹绿色荧光蛋白质粒。方法:采用PEG8000病毒浓缩法、β-丙内脂法从Hep G2.2.15细胞上清液中制备HBVE基因转移载体,分别用HBVE及脂质体包裹绿色荧光蛋白质粒(pIRS2-EGFP)后转染Hep G2细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞发光率。结果:荧光显微镜下观察可见,脂质体组及HBVE组均可见绿色荧光蛋白的表达,HBVE组较之脂质体组具有更高的荧光强度;流式细胞仪检测结果显示,脂质体组的转染效率为49.97%,而HBVE组转染效率为70.65%,其转染效率及荧光强度明显高于脂质体组,P=0.000。结论:HBVE包裹绿色荧光蛋白质粒较之脂质体包裹在HepG2细胞中具有更好的转染效果。

蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素诱饵蛋白质粒构建

(1)目的构建α-4贾第素诱饵蛋白质粒,为贾第素功能的研究奠定基础。(2)方法从α-4贾第素克隆载体pGM-T-α-4中双酶切获得α-4贾第素编码序列,与酵母表达质粒pGBKT7在DNA连接酶的作用下进行重组,重组载体通过热休克法转化大肠杆菌感受态细胞,大肠杆菌经过培养、筛选,碱裂解法提取质粒酶切鉴定获得pGBKT7-α-4诱饵载体。并对诱饵载体进行自激活验证,利用Western blot鉴定诱饵蛋白的表达情况。(3)结果经酶切和测序鉴定,获得了pGBKT7-α-4诱饵载体。转化子Y187酵母细胞在SD/-Trp平板上能够生长;而在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade平板上不能生长。说明pGBKT7-α-4质粒无自我激活作用。Western blot鉴定结果显示,pGBKT7-α-4转化酵母菌在52KD水平位置可检测到α-4融合C-Myc蛋白的表达。(4)结论构建α-4贾第素诱饵蛋白质粒。诱饵蛋白质粒无自我激活作用,在酵母菌株中表达良好,为贾第素功能的研究奠定了基础。

超声微泡造影剂携绿色荧光蛋白质粒转染大鼠股骨头的研究

以SD大鼠为实验对象,研究超声微泡造影剂携绿色荧光蛋白质粒转染股骨头的可行性和安全性.分组实验后发现各组大鼠大体形态状况以及HE染色观察未发现骨组织损伤;应用超声微泡造影剂为载体的大鼠股骨头,绿色荧光蛋白质粒表达高于其他各组.故认为超声微泡造影剂携绿色荧光蛋白质粒转染大鼠股骨头组织是安全和可行的.

孤立性心房颤动患者血浆血小板α颗粒膜蛋白-140和血栓素B_2及6-酮-前列腺素F_(1α)浓度变化的研究

目的研究孤立性心房颤动(房颤)患者血小板功能改变,探讨房颤引起血栓前状态的原因。方法用放射免疫分析法对21例孤立性阵发性房颤(A组)、28例孤立性持续性房颤(B组)患者分别于房颤发作及终止后1周测定外周静脉血浆血小板а颗粒膜蛋白-140(GMP-140)、血栓素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-K-PGF1α)浓度,并与27例风湿性心脏病二尖瓣狭窄伴持续性房颤(C组)、32例阵发性室上性心动过速患者(D组)及与20例健康体检者(对照组)相比较。结果A、B组患者房颤发作时及C组患者GMP-140、TXB2和TXB2/6-K-PGF1α比A组患者房颤终止后1周和D组及对照组明显上升。A组患者血浆GMP-140、TXB2浓度及TXB2/6-K-PGF1α与房颤发作时间呈正相关,而与患者年龄、性别及左心房内径等临床参数无关。结论无论是器质性心脏病房颤还是孤立性房颤,无论是阵发性房颤还是持续性房颤都存在血小板的激活和血管内皮细胞功能损伤。

血小板活化因子乙酰水解酶对局灶性脑缺血大鼠神经分泌素表达的影响

目的探讨重组人血小板活化因子乙酰水解酶(rPAF-AH)对局灶性脑缺血大鼠缺血区神经分泌素表达的影响。方法选择SD大鼠45只,随机分为假手术组、生理盐水组、rPAF-AH组,每组15只,每组再分为2、7、14d3个时间点,每个时间点5只。生理盐水组和rPAF-AH组建立大脑中动脉栓塞模型。采用酶联免疫吸附法检测神经分泌素表达水平。结果生理盐水组和rPAF-AH组2、7、14d缺血区神经分泌素表达明显高于假手术组(P<0.05),且rPAF-AH组2、7、14d缺血区神经分泌素表达明显高于生理盐水组[(81.76±9.14)ng/ml vs(40.89±4.32)ng/ml,(114.49±5.79)ng/ml vs(50.39±5.22)ng/ml,(88.82±9.79)ng/ml vs(40.17±3.00)ng/ml,P<0.01]。结论 rPAF-AH能够上调局灶性脑缺血大鼠神经分泌素表达,可能对脑缺血神经重构起促进作用。

SA脂质体介导报告基因转染耳蜗的实验研究

目的 探索直接注射质粒及SA脂质体与质粒复合物在豚鼠耳蜗内表达的情况。方法 以构建的含绿色荧光蛋白基因pEGFP cDNA的重组真核表达质粒为外源基因,与SA脂质体一起转染内耳耳蜗毛细胞;通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果 使用阳离子脂质体SA的脂质体质粒复合物组转染耳蜗,表达效率高于单纯质粒组,于转染后48h表达出的蛋白量最大。结论 应用脂质体及直接注射法是使外源基因在豚鼠耳蜗内表达的简便、有效途径。

阳离子脂质体介导pEGFP-N1转染HepG2.2.15细胞效率初探

目的探讨阳离子脂质体介导绿色荧光蛋白质粒转染HepG2.2.15细胞的转染效率。方法以阳离子脂质体包裹绿色荧光蛋白质粒转染HepG2.2.15细胞,观察不同配比的脂质体与绿色荧光蛋白的转染率。结果对照组未见绿色荧光蛋白表达,各实验组HepG2.2.15细胞均可见绿色荧光蛋白表达,表达量随脂质体浓度增加而增加(P<0.05),最高转染率为23.22%。结论阳离子脂质体能有效地介导绿色荧光蛋白质粒转染HepG2.2.15细胞。

转基因动物中慢病毒载体包装的优化

慢病毒载体作为基因治疗载体发展起来,现已用于转基因动物制备。本实验用磷酸钙沉淀法将转移质粒(pCCL-hCMV-eGFP)、包装质粒(pCMVΔR8.9)、包膜蛋白质粒(pMDG(VSV-G))三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞—293T,转染48h后收集病毒上清,采用6孔板培养感染细胞,荧光显微镜计数EGFP阳性细胞法测定病毒滴度。载体滴度达2×107TU/ml左右。

小儿胆汁淤积性肝病的病因学特征

目的研究胆汁淤积性肝病（CLD）患儿的主要病因学特征，并探讨SLC25A13基因突变类型在CLD的分子流行病学分布。方法2003年10月至2009年3月问我科诊治的CLD患儿63例，其中男36例，女27例。采用临床横断面研究，收集整理研究对象的临床资料，分析总结其病因及临床转归；应用课题组已建立方法常规筛查SLC25A13基因的13～17种突变类型；在部分患儿中通过基因组DNA直接测序寻找SLC25A13基因突变。结果63例CLD患儿中有24例病因不明，另外39例病因明确。在已明确的CLD病因中，遗传代谢病居首位，包括citrin缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症（NICCD）、暂时性半乳糖血症、酪氨酸血症Ⅰ型、半乳糖激酶缺陷病、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷病和糖原累积病Ⅰ型等6种疾病共27例患儿，其中NICCD 21例；其次是获得性因素，包括全胃肠道外营养相关胆汁淤积症、巨细胞病毒肝炎和先天性梅毒共7例；再次为先天性胆道畸形，包括胆道闭锁、Caroli病和胆囊息肉共5例。55例随访CLD患儿中有10例已夭折，其余45例临床改善或痊愈。44例CLD患儿接受了SLC25A13突变分析，其中来自20个家庭（共40个等位基因）的21例患儿被发现携带基因突变。检测到的7种突变类型分别为851—854del（23／40），IVS6＋5G〉A（6／40），IVS16ins3kb（3／40），1638—1660dup（2／40），A541D（1／40），R319X（1／40）和G333D（1／40），还有3个等位基因中的新突变有待识别（3／40）。结论虽部分CLD患儿病因不能明确，但遗传代谢病，尤其是NICCD，是CLD的常见病因。少数CLD患儿预后不良，但大部分患儿可获临床改善甚至痊愈。本组检测到SLC25A13基因突变类型7种，其中前4位最常见者依次是851—854del，IVS6＋5G〉A，IVS16ins3kb和1638—1660dup。

不同超声强度及微泡对基因和组织作用的实验研究

目的探讨不同强度超声破坏微泡对绿色荧光蛋白质粒(green fluorescent protein, GFP)和小鼠骨骼肌组织的作用.方法分别用 0.5 W/cm2、1.0 W/cm2、2.5 W/cm2的超声作用于基因及基因和微泡的混合物2 min,琼脂糖凝胶电泳观察质粒基因的电泳图谱变化.并将昆明小白鼠16只分为4组,尾静脉输入白蛋白微泡,同时分别用 0.5 W/cm2、1.0 W/cm2、2.0 W/cm2、2.5 W/cm2的超声作用于小鼠骨骼肌2 min,取局部组织HE染色观察超声破坏微泡后组织显微结构的变化.结果不同能量的超声和微泡作用后GFP质粒的电泳图谱结果无变化.0.5 W/cm2超声破坏微泡后无血管充血及红细胞渗出;1.0 W/cm2超声破坏微泡后可引起约30%血管充血,极少量红细胞渗出;2.0 W/cm2超声破坏微泡后可引起约60%血管充血,红细胞渗出较明显;2.5 W/ cm2的超声破坏微泡后可使部分骨骼肌变性.结论用 1.0 W/cm2和 2.0 W/cm2超声作用2 min后引起血管充血,红细胞渗出;2.5 W/cm2超声作用2 min破坏微泡后可损伤组织.1.0～2.0 W/cm2超声强度破坏微泡后对GFP质粒无明显的损害.

新型纳米材料HPC-g-PDMAEMA作为基因载体的研究

目的研究新型纳米载体HPC-g-PDMAEMA(HPD)对于不同肿瘤细胞系的转染能力,评价其在基因治疗及研究中的作用,并且初步探索HPD对于siRNA的运载能力。方法 HPD和脂质体2000(Lipo 2K)运载绿色荧光蛋白(GFP)质粒,分别转染MCF7、973、JF305 3种肿瘤细胞系,采用流式细胞仪检测其转染效率;HPD和Lipo 2K运载针对GADPH的siRNA,转染MCF7,利用RT-PCR检测其RNA转染效率。结果对于MCF7细胞,HPD的DNA转染效率高于Lipo 2K;对于973细胞,二者转染效率相近;对于JF305细胞,HPD转染效率低于Lipo 2K。在MCF7细胞中,利用HPD进行RNA转染,效率低于Lipo 2K。结论对于不同的肿瘤细胞系,可以采用不同的基因载体进行转染,从而提高转染效率。