人酸性成纤维细胞生长因子基因重组腺病毒粘粒载体的构建

目的 :构建人酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)重组腺病毒粘粒载体。方法 :抽取人胎脑组织mRNA ,经RT PCR获取aFGF基因 ,测序后将其插入腺病毒粘粒载体pAxCAwt的SwaI位点。结果 :RT PCR合成的DNA片段经克隆、测序后证实为aFGF基因 ,酶切结果显示 ,aFGF腺病毒重组粘粒 (pAxCAwt aFGF)中aFGF的插入方向正确。结论 :构建的aFGF腺病毒重组粘粒 (pAxCAwt aFGF)可用于进一步的基因治疗的研究中 。

用粘粒载体构建山羊基因组文库

为配合山羊乳腺生物反应器的研究,构建定点整合'打靶框架'和筛选同源基因,用SuperCosl建立了山羊基因组粘粒文库.本试验共获得3.62×105个克隆,阳性克隆率达到97.5%,插入片段大小为34～45kb,平均为40kb.用5对引物分别对文库做PCR分析,均有特异性扩增.

用粘粒载体克隆霍乱弧菌染色体基因方法的建立

本文采用我国 El Tor 型霍乱弧菌805菌株(稻叶血清型,噬菌体-生物型 ld)为实验菌株,对粘粒载体(Cosmid)基因克隆的方法,进行了探索.首先从感染噬菌体λ突变体的溶原菌(HB 2688,HB2690)制备包装抽提物。制备方案有二:一是直接制备 HB2688,HB2690混合包装抽提物;另一是用超声波处理制备 HB2690抽提物;用冻融法制备 HB2688抽提物.包装时再将两者混合.本文认为以 pHC79为载体进行包装时,两方案效果一样,第一方案操作较简便些.在核酸操作中,从805菌株提取染色体 DNA,要求 DNA 的长度约为100kb;进行染色体 DNA部分消解时,应使大部分 DNA 片段在30～40kb 之间;连接时,碱性磷酸酶处理过的载体量应为30～40kb DNA 的10倍.本文以 pHC79为载体,建立805菌株染色体 DNA 无性繁殖系,得到500多个克隆子。

新疆O139群霍乱弧菌93006菌株基因组文库的构建

目的 :构建我国新疆分离O1 39群霍乱弧菌菌株 (930 0 6菌株 )的基因组文库 ,为研究我国O1 39群霍乱弧菌的来源及其基因组特征提供资料。方法 :制备霍乱弧菌高相对分子质量的基因组DNA ,用Sau3AI酶将基因组DNA部分酶切成平均大小为 32～ 4 0kb的片段 ,将部分酶切并经碱性磷酸酶 (CIAP)处理的DNA片段与经XbaI、CIAP、BamHI处理的粘粒载体SuperCos1的载体臂相连接 ,连接产物经体外包装并转染大肠杆菌XL Blue1MR ,经氨苄抗性筛选得到阳性克隆 ,构建霍乱弧菌的基因组文库。结果 :该文库共获得了 1 2 0 0个单克隆 ,平均插入片段的大小为 32kb ,空载率为 0 .0 5 % ,相当于 9个库容量 ,从本文库中筛选到任一霍乱弧菌的DNA单拷贝序列的机率为99.98% ,该文库能承受 7次反复冻溶。结论 :成功构建了我国新疆分离O1 39群霍乱弧菌菌株 930 0 6的基因组文库 ,为进一步克隆霍乱弧菌的基因和研究我国O1

枯草芽孢杆菌B9601-Y_2基因组文库的构建

枯草芽孢杆菌B9601-Y2是一个具有防治植物病害和促进植物生长的专利菌株。本文采用Sau3A I部分酶切的DNA、粘粒载体pLARF-5和PackageneλDNA包装系统,构建了该菌株基因组文库。文库总量为11 000个克隆,插入片段平均长度为14.77 kb,按99.99%的概率计算,文库覆盖了基因组4.2次。这为该菌株防治病害和促进植物生长机理研究奠定了物质基础。

中国人丙型肝炎病毒核心基因cDNA在HepG2细胞中的表达

目的：将中国人丙型肝炎病毒（HCV）核心基因cDNA克隆到真核细胞表达载体pTM3中，并在HepG2细胞中表达HCV核心蛋白．方法：利用DNA重组技术,将HCV／C基因cDNA定向克隆到pTM3中,采用痘苗病毒／噬菌体T7多聚酶短暂表达体系,在Lipofectin介导下将重组质粒转染HepG2细胞。结果：重组质粒转化Top10F＇细菌,随机挑取10个Amp抗性克隆,经EcoRⅠ、PstⅠ酶切鉴定，得到2个pTM3-Q534克隆。HepG2转染细胞以间接免疫荧光法鉴定证实存在HCV核心蛋白的表达．结论：HCV／C基因cDNA在粘粒载体中已获得克隆和初步表达．