大肠杆菌LTKA63突变体的构建及重组LTKA63免疫佐剂活性机理的研究

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位（heat-labile enterotoxin subunitA，LTA）基因减毒突变体LTKA63及其原核表达系统，探讨重组LTKA63（rLTKA63）粘膜免疫佐剂活性的机制。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA基因，利用定位突变技术构建LTKA63突变体，T-A克隆后测序。采用无His-tag的原核表达载体pET-15b。构建LTKA63原核表达系统，通过SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA基因条带。与报道的LTA序列比较，所克隆的LTA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．03％～99．61％和98．33％～99．22％。LTA基因定位突变后获得序列正确的LT-KA63突变体。rLTKA63表达量占细菌总蛋白的15％左右。rLTKA63作用后Th1和Th2细胞较阴性对照组分别增加21．9％和36．2％。结论本文成功地构建了LTKA63原核表达系统，所表达的rLTKA能同时激活Th1和Th2细胞。