粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中组成型表达及分离纯化

将粪产碱杆菌青霉素G酰化酶基因构建重组表达质粒pKKFPGA ,pKKFPGA再转化宿主菌DH5α,所得重组菌不需诱导便能高效表达青霉素G酰化酶 ,表达量达 2 5 90u L ,比野生型粪产碱杆菌表达量高 4 32倍 ,其菌体比活力达 30 0 (u L) A6 0 0 。菌体破碎后的上清液经DEAE_SepharoseCL 6B离子交换层析和Butyl_SepharoseCL 4B疏水层析 ,即可得纯度提高 2 0倍、比活为 6 8 6u mg的青霉素G酰化酶 ,两步纯化的总收率达 91%。Western印迹分析表明 5 %的原前体青霉素酰化酶在胞内形成了包涵体 。

粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的分离纯化及酶学性质

采用DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Butyl-Sepharose CL 4B疏水层析，从重组大肠杆菌DH5α菌体中分离纯化得到粪产碱杆菌青霉素G酰化酶（AfPGA）。经纯化，AfPGA纯度较粗酶提高50．6倍、比活达到212．7U／mg，经HPLC测定纯度为92．8％，收率为78％。理化性质分析表明：AfPGA含有2个亚基（α亚基和β亚基，其Mw分别为2．90×10^4和5．92×10^4；AfPGA等电点约为7．9～8．0，最适pH约为10．0，并在pH〉7．0时表现出了稳定的催化活力。

固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的制备

粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶通过共价结合在环氧型载体Eupergit C上,通过对酶质量浓度、固定化反应时间、pH值以及反应温度等条件的考察,确定了最优固定化条件:375mg比活力5 000U/g的重组粪产碱杆菌青霉素G酰化酶蛋白对应1g载体,最适pH 8.0,反应温度30℃。反应120h后制得固定化青霉素G酰化酶活力达到220U/g,固定化酶效率为10.7%。该固定化酶可在含饱和乙酸丁酯磷酸缓冲液中彻底水解青霉素G钾盐。经过15批连续水解反应,固定化酶仍保持95%的活力,展现出良好的稳定性。

以部分水解的淀粉发酵重组枯草芽孢杆菌WB600（pMA5）生产粪产碱杆菌青霉素G酰化酶

本研究利用重组枯草芽孢杆菌WB600（pMA5）生产粪产碱杆菌青霉素G酰化酶（PGA）。利用含25g/L可溶性淀粉的复合培养基进行分批发酵，所得PGA活力及总产率分别为378IU／L及7．13IU·（L·h）^-1。补料分批培养结果表明葡萄糖对PGA的生产有抑制作用。淀粉是良好的碳源，但在加热灭菌后因黏度高而不能直接作为补料成分。实际补料采用少量α-淀粉酶部分水解后的淀粉，可大幅提高其流动性，且不易生成葡萄糖。利用此淀粉发酵培养可使PGA产量提高至546IU／L。当发酵液中加入部分水解的淀粉与胰蛋白胨的混合物，且采用pH恒定技术时，PGA活力可达1960IU/L，是分批发酵的5倍，总产率为19．6IU·（L·h）^-1，是分批发酵总产率的两倍以上。

巨大芽孢杆菌BP931胞外青霉素G酰化酶的产生条件

研究了巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BP 931胞外青霉素G酰化酶的产生条件。菌在由葡萄糖0.7％,氮源1号0.5％,酵母膏1.0％和苯乙酸0.8％组成的液体培养基(灭菌前pH9.0,灭菌后pH8.0)中,28℃振荡培养44h。以6-硝基-3-苯乙酰胺基苯甲酸为底物,培养滤液酶活力为9.0IU/ml。诱导物苯乙酸于培养6h后加入,酶活力可以提高到11.0IU/ml。Ca^(2+)、Al^(3+)、Sn^(4+)、Mn^(2+)和Fe^(2+)离子降低酶的形成;Cu^+和C0^(2+)离子显著抑制菌生长,降低酶的形成;Zn^(2+),Cd^(2+)和Hg^(2+)离子完全抑制菌生长和酶形成。

粪产碱杆菌D-氨基酰化酶的分离纯化及发酵条件优化

采用热激法将含粪产碱杆菌D-氨基酰化酶基因载体的质粒导入大肠杆菌,筛选重组子,对该工程菌产生的D-氨基酰化酶用Ni 2+柱进行分离纯化;通过单因素实验优化D-氨基酰化酶的发酵条件。结果表明,纯化后的D-氨基酰化酶比活力为456.71U·mg-1,纯化回收率为50%,纯化倍数为12.4倍;最佳发酵条件为:37℃通气培养至菌体浓度OD600值为0.6时,加入0.5mmol·L-1诱导剂IPTG诱导5h,在此条件下,D-氨基酰化酶酶活力为90.9U·mL-1。

粪产碱杆菌ZWS11菌株对烟嘧磺隆的酶促降解特性

为明确粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis ZWS11菌株对烟嘧磺隆的酶促降解特性,采用丙酮沉淀、超声波破碎和高速离心等方法,提取制备了ZWS11菌株的胞外和胞内粗酶液以及菌体碎片悬浮液,并分别测定了其酶活力。结果表明：当V（菌体发酵液）：V（丙酮）=1：3时提取到的胞外粗酶液具有较高的酶活力;胞外粗酶液、胞内粗酶液和菌体碎片悬浮液对24.9μmol/L烟嘧磺隆的平均降解率分别为87.4%、16.9%和17.4%,胞外粗酶液的降解能力与胞内粗酶液或菌体碎片悬浮液相比差异显著（P〈0.05）,由此确定对烟嘧磺隆起降解作用的酶属于胞外酶。最适降解条件研究表明：该降解酶的酶促反应适宜温度为35℃,较适p H值为6.0,反应时间为30 min,在此条件下其对烟嘧磺隆的降解率在80%以上。此外,该降解酶在35~70℃、p H值4.0~9.0范围内均能够保持较高的酶活力,对烟嘧磺隆的降解率均在60%以上,表明该降解酶具有较好的热稳定性和酸碱稳定性。加入不同浓度十二烷基硫酸钠（SDS）和苯甲基磺酰氟（PMSF）,对该降解酶的活力表现出了不同程度的抑制作用。研究结果可为烟嘧磺隆降解酶制剂的规模化生产及被烟嘧磺隆污染土壤的生物修复提供科学依据。

青霉素G酰化酶通用表达载体的构建方法初探

结合信号肽预测软件 (SignalP)对现有的青霉素G酰化酶 (PGA)的大肠杆菌 枯草杆菌穿梭表达质粒pZ0 1进行信号肽的合理设计 ,在其C 端置换 2个氨基酸 ,即引入NotI酶切位点序列 ,从而构建成PGA的通用表达载体。将粪产碱杆菌 (Alcaligenesfaecalis)的PGA基因导入其中 ,构建成表达质粒pzfpganoti.,转入枯草杆菌进行表达 ,测活结果显示 ,表达产物具有生物活性 (酶的平均活力为 0 .18U ml发酵液 )。为进一步应用信号肽预测软件进行表达系统的研究、设计打下了基础。

来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因的合成与融合表达

将来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因用大肠杆菌中的丰沛密码子替换,利用化学和基于聚合酶链反应(PCR)技术的酶促方法进行基因全合成,利用pET-32a构建重组表达载体pET-dan,转化进E.coil BL21(DE3)中进行融合表达.经SDS-PAGE电泳、Western-blot检测和活性测定发现,D-ANase可在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白可达到菌体总蛋白的69.2%,密码子优化后基因构建的工程菌发酵活性为96 U/mL,重组蛋白经超声细胞破碎及Ni2+柱亲和层析纯化,比活可达1692.3 U/mg,纯度可达95%以上.

增强组成型重组大肠杆菌质粒稳定性的发酵策略

质粒稳定性是影响基因工程菌外源蛋白表达的重要因素,同时,外源蛋白的表达又影响着质粒稳定性。与诱导型表达系统相比,在组成型表达系统中,由于外源蛋白的持续表达,导致细胞代谢负担加重,质粒稳定性的控制更加困难。通过对组成型大肠杆菌DH5α/pKKFPGA发酵过程的优化,增强了质粒稳定性,发酵结束时,仍然维持在85%左右,表达产物粪产碱杆菌青霉素酰化酶的酶活单位达到23 384 U.L-1。

细菌产生的新的β-内酰胺类抗生素——Sulfazecin和Isosulfazecin

以往发现的β-内酰胺类抗生素主要由放线菌、真菌所产生,几种植物病原细菌也只产生β-内酰胺类结构的毒素。本文报导从假单孢杆菌的新种中第一次发现两种新的β-内酰胺类抗生素——Sulfazecin 和 Iso-sulfazecin。作者使用绿脓杆菌超敏感菌 PsCss和缺乏染色体控制的β-内酰胺酶与青霉素结合蛋白 PBP-1B 的大肠杆菌超敏感菌 PGB,以 pH4.5琼脂平板筛选土样。