粪产碱菌的Tn5转座诱变及吲哚乙酸生物合成特性的研究

粪产碱菌 (Alcaligenesfaecalis)A1 50 1的吲哚乙酸 (IAA)合成需要外源色氨酸参与。在不含色氨酸的限制性培养基中 ,A1 50 1能良好生长 ,但不能合成IAA ,表明在A1 50 1中存在一条依赖于色氨酸的IAA合成途径。A1 50 1的IAA合成具有菌体密度依赖特性。采用Tn5转座诱变技术构建A1 50 1的突变库 ,从 350 0多株Tn5转染子中分离到一株色氨酸营养缺陷型突变株AT63。该Tn5突变株在不含色氨酸的限制性培养基上不能生长 ,但仍能进行IAA的生物合成 ,每毫升菌体密度等于 1 0的突变株菌体的IAA合成量为 2 2 4 μg。对突变株AT63的研究表明在A1 50 1中至少存在两条IAA合成途径 :一条以色氨酸为合成前体 ,另一条以吲哚 - 3-磷酸甘油为前体。southern杂交结果表明突变株中Tn5插入位点可能位于编码色氨酸合成酶基因上。

粪产碱菌耐铵工程菌与水稻联合共生固氮作用

粪产碱菌（ Ａａｅｃａｌｉｓｆａｅｃａｌｉｓ） 在ＬＷ 培养基下能产生植物激素ＩＡＡ。盆栽结果表明，接种Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ 显著提高了水稻的生长，接种Ａ１５０１ 和Ａ１５１３ 的水稻稻谷产量分别比未接种提高了８５％ 和１０３ ％ ，用１５ Ｎ 同位素稀释法估测水稻地上部总氮中来源联合固氮的百分率达９００ ％ 和１１５ ％ ，其结果与水稻地上部（ 茎叶及稻谷） 总氮量的增加幅度（８６ ％ 和１１６ ％ ）基本一致。研究还表明Ａ１５１３ 耐铵工程菌的产ＩＡＡ作用以及对水稻的生长和产量、联合固氮作用均优于原始菌株Ａ１５０１ 。

家蝇幼虫体内的粪产碱菌有抑菌能力

目的：从家蝇幼虫体内分离出粪产碱菌，并观察其抑菌能力。方法：对家蝇幼虫匀浆，按常规方法分离细菌，在无菌条件下进行抑菌试验。结果：粪产碱菌对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等致病菌有很强的抑菌能力。动物实验证实，蝇蛆粉能治愈绿脓杆菌感染的创伤。结论：蝇蛆体内可能存在一组微生物，参与机体的防御体系，保护它们在极其恶劣的环境中存活。

一株高效废水除臭粪产碱菌的筛选及除臭特性研究

为了研究新型微生物除臭剂,以氨和硫化氢去除率为指标,采用驯化富集、稀释涂平板和分区划线的方法,从垃圾渗滤液中筛选出4株除臭菌。通过初筛和复筛试验获得1株除臭率最高的菌株,命名为X3。该菌株对氨和硫化氢的去除率分别为85%和82%。经过形态学观察、生理生化试验及16S rRNA基因分析,X3为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)。对其除臭特性进行了研究。结果表明:随生长曲线进入对数期,除臭率也呈现对数增长,在稳定期时,除臭率达到最高;上清液对氨和硫化氢的去除率分别为37%和30%,而下沉细胞对氨和硫化氢的去除率高达83%和79%,因此,该菌的主要除臭成分为活体细胞。

粪产碱菌对水稻根质子分泌作用及根际微生态的影响

用粪产碱菌浸种或沾根均能增强水稻根的质子分泌能力,促使介质酸化,pH值下降约2.2,浸种的效应更为明显。接种粪产碱菌能刺激水稻在缺铁胁迫条件下的质子分泌作用,提高根际溶液和根内ATP含量,同时增强根际土壤中铁、磷元素的有效性,促进植物根系对磷的吸收利用。

粪产碱菌与水稻根的联合过程

应用^(15)N同位素标记菌体和Tn5转座子诱变的突变株研究固氮粪产碱菌对宿主水稻的联合进程,结果表明,粘附作用是结合过程的第一步,接种3h后粘附在根表的菌体数量达最大值,约占接种量的3.7％。粘附的菌体易脱离根表,表明粘附作用是细菌与宿主植物间的弱的相互作用。在根表定位是结合过程的第二步。接种15h后,定位菌体数量达最大值,约占接种量的21％。经振荡处理不能使定位菌体脱离根表。定殖是结合过程的第三步,接种20h后定殖菌体紧密结合于根表,剧烈振荡亦不易使其脱离根表。定殖后菌体开始出现果胶酶活性。采用趋化(Che)和胞外多糖(Exo)突变株研究表明,趋化性和胞外多糖的合成是影响细菌在根表结合的重要因素。粪产碱菌在水稻根表没有专一的粘附部位,但粪产碱菌的定位和定殖主要发生在主根根表,尤其是主、侧根交接处。

响应面法优化粪产碱菌Alcaligenes faecalis DL-08产纤维素酶培养工艺

利用粪产碱菌Alcaligenes faecalis DL-08,进行产纤维素酶培养,在Plackett-Burman设计基础上,通过Design-Expert中心组合实验,建立了培养条件优化的二次回归模型,并通过响应曲面分析,确定了最佳培养条件。由响应面分析结果可知,产纤维素酶条件:温度37.98℃,碳氮比1∶1,接种量2%,初始p H 7,时间24 h。在此条件下,预测值OD520为1.237。经3组平行试验,OD520平均值为1.229,与模型预测值基本一致,且与未优化条件相比,纤维素酶活力提高了5.6%,可达1 303.2 U/m L。

粪产碱菌(Alcaligenes faecalix)基因文库的构建和nifH基因同源顺序的克隆

采用λ噬菌体置换型载体EMBL4,构建了Alcaligenes faecalis A-15 H1菌株总DNA的基因文库。用Sau3AⅠ限制酶完成部分酶切,取13—20kb大小的片段进行克隆。载体DNA经BamHⅠ和SaiⅠ完全双酶切,左右臂“退火”形成左右臂载体分子后再与外源片段连接。左右臂载体分子与外源片段按照1:1的分子比进行体外连接。用E.coli BHB2688和E.coli BHB2690制备的包装抽提物进行体外包装,所得基因文库效价测定为1.2×10~6 pfu,远远超过理论上所需的库容量。以nif H基因作为探针,经3轮噬菌斑原位杂交,从基因文库中筛选出含有其同源顺序的克隆,并得到了梯度点杂交的验证。对所得重组噬菌体克隆之一进行Southern转移杂交,结果证实,其3.5kb的EcoRⅠ酶切片段为nif H阳性杂交条带。将其克隆到质粒pUC19 DNA上后,转入受体菌JM101中。再次经Southern转移杂交,证明所得重组质粒克隆(pAFH)含有粪产碱菌中的与nifH基因有同源顺序的片段。

粪产碱菌nifH启动子与LacZ的融合基因构建及其表达调控

在ｐＲＫ２９０载体上将粪产碱菌固氮酶基因ｎｉｆＨ的启动子与报告基因ＬａｃＺ相融合，获得表达载体ｐＳＫ６，并转导到粪产碱菌Ａ１５０１菌株中，探讨了铵和氧对该启动子的表达调控．结果表明，粪产碱菌ｎｉｆＨ启动子仍受到铵和氧的调节．当铵浓度大于３ｍｍｏｌ／Ｌ时，其表达水平大幅度下降，但铵浓度高达４０ｍｍｏｌ／Ｌ，仍有很低水平表达．而且，带有巴西固氮螺菌ｎｉｆＨ∶ｌａｃＺ的粪产碱菌接合子在高铵条件下（４０ｍｍｏｌ／Ｌ）也有低水平表达．此外，氧对粪产碱菌的ｎｉｆＨ启动子有抑制作用，这在无铵条件下表现最为明显．

含几丁质酶基因的粪产碱菌工程菌(BC2007)的构建

从苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)中扩增出几丁质酶全长基因,通过克隆,测序得到2025 bp的序列。通过再线生物信息学软件,得到该几丁质酶的一级、二级、三级结构。将该基因通过电转化导入原核表达载体pET29 a,筛选到含该几丁质酶基因的BC2007。初步研究表明BC2007在含胶体几丁质的平板上产生了透明圈。

固氮粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）胞外多糖的分离纯化及成分分析

固氨粪产碱菌野生型Ａ１５０１菌株及其胞外多糖（ＥＰＳ）突变株Ｅｘｏ＋＋（Ａ１５３２）和ＥｘＯ－（Ａ１５３１），以及ｎｉｆＡ和ｎｔｒＣ－ｎｉｆＡ转化子（Ａ１５１３和Ａ１５２３）的ＥＰＳ，由高分子量（２５０ｋＤ左右）组分（ＥＰＳＨ）和低分子量小于４０ｋＤ组分（ＥＰＳＬ）组成。两个组分中均含有葡萄糖、半乳糖、果糖和戊糖，其主要成分葡萄糖和半乳糖的分子摩尔比：Ａ１５０１－ＥＰＳＨ为２：１、ＥＰＳＬ为３：１；Ａ１５３１－ＥＰＳＨ为２：１、ＥＰＳＬ为１：１；Ａ１５３２－ＥＰＳＨ为８：１、ＥＰＳＬ为５：１；Ａ１５１３－ＥＰＳＨ和ＥＰＳＬ均为４：１；Ａ１５２３－ＥＰＳＨ为４：１、ＥＰＳＬ为８：１。高分子量ＥＰＳ中还含有多肤，其氨基酸组分在各突变株和转化子之间差异明显，而ＥＰＳＬ中仅含有痕量多肽。

固氮粪产碱菌（Alcaligenesfaecalis）胞外多糖的理化特性分析

ＥＰＳ结构分析表明，ＥＰＳ突变株及工程菌株的糖骨架结构与野生型菌株相比有差异，尤其是ｎｔｒＣｎｉｆＡ基因结合子Ａ１５３２的糖骨架结构明显不同于其它菌株，各个菌株之间，其侧链基团均稍有改变。ＥＴＩＲ证实，各个菌株ＥＰＳ中蛋白构象存在差异，ＥＰＳ中均有丰富的β折叠构象。ＥＰＳ丰富型突变株中无规卷曲构象所占比例较大，而野生型菌株中ＥＰＳ则没有无规卷曲构象。

粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）对稻根氧化还原特性及水稻多元酚和内根际激素水平的影响

联合固氮粪产碱菌结合于水稻根表时能增强水稻根部还原力和稻根超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性。实验室和田间试验证明粪产碱菌能提高水稻幼苗对高、低温不良环境的抗逆性。经浸种处理的水稻幼苗植株内多元酚含量增加了１２．５％。粪产以菌对接种水稻多元酚抽提物有强烈的趋化性，而该抽提物对粪产碱菌的固氮活性有明显的刺激作用。多元酚抽提物经双向纸层析和薄层层析表明接种诱导了至少一个特征组分含量提高。采用粪产减菌野生型Ａ１５０１（ｎｉｆ＋）和固氮缺陷型Ａ１５０６（Ｎｉｆ－）浸种能改变宿主水稻内源激素水平，提高内根际的ＩＡＡ和Ｚ的含量，促进植株及根系的生长发育，使其侧根和根毛数目明显增多。在根际联合体系形成过程中，多元酚或激素可能充当植物与细菌间相互作用的一类特异信号分子。

N_2和NH_4^+培养下粪产碱菌固氮酶钼铁蛋白的合成及其特性

应用柱层析和制备电泳分别将N_2和 NH_4^+培养的粪产碱菌固氮酶钼铁蛋白(Af 1和Af 1)分离并纯化,两者理化性质十分相似。分子量分别为226 kD和 222 kD;α亚基和β亚基分子量分别为57 kD和60 kD;氨基酸种类相同,总残基数分别为1790和1750;每分子Af 1和Af 1均含有2个原子Mo和32个原子 Fe;金属原子簇的氧化还原当量数为6。Af 1的比活性为 1477 nmolC_2H_4 mg^(-1)protein min^(-1),Af 1无活性;分子结构两者有差异。

N2和NH4^＋培养下粪产碱菌固氮酶铁蛋白圆二色谱及热力学特性比较

Ｎ２和ＮＨ培养下粪产碱菌固氮酶铁蛋白（分别为Ａｆ２和Ａｆ＊２）的氧化态和还原态的ＣＤ谱及ＭＣＤ谱存在明显差异。还原态Ａｆ２与Ａｆ＊２在２１０ｎｍ附近的ＭＣＤ谱完全不同，但它们的氧化态ＭＣＤ谱相同。热力学测定结果表明．在２９８°Ｋ，１．０１３×１０５Ｐａ下，Ａｆ２与ＭｇＡＴＰ饱合络合时的培（△Ｈ°）变化为－２７．０ｋＪ／ｍｏｌ，自由能（△Ｇ°）变化则为－２０．８ｋＪ／ｍｏｌ．熵（△Ｓ°）变４也为－２０．６Ｊｍｏｌ－１Ｋ－１。而Ａｆ＊２与ＭｇＡＴＰ饱合络合时的烂变化为－４４．３５ｋＪ／ｍｏｌ，自由能变化为一２０．４ｋＪ／ｍｏｌ，熵变化为－７９．９Ｊｍｏｌ－１Ｋ－１。Ａｆ２与ＭｇＡＴＰ络合后再与Ｎ２培养的钼铁蛋白反应为吸热反应，而Ａｆ＊２与ＭｇＡＴＰ络合后再与ＮＨ培养的钼铁蛋白反应为放热反应。

固氮粪产碱菌谷氨酰胺合成酶的构象变化及调节作用

应用园二色谱测定了粪产碱菌谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）各构象，结果表明在Ｇｌｕ培养下ａ螺旋为２８％，β折叠为２２％，无规则卷曲占５０％；而在ＮＨ４＾＋培养下，三者相应为２０％，２０％，６０％。荧光光谱及付立叶红外光谱也证明，两种培养条件下ＧＳ的构象存在着差异。不同氮源对粪产碱菌ＧＳ的形成有显著的影响。高浓度ＮＨ４＾＋培养下ＧＳ合成受到阻遇，而Ｇｌｕ或低浓度ＮＨ４＾＋则对ＧＳ合成无明显的影响。

N_2和NH_4^+培养下粪产碱菌固氮酶铁蛋白的生物合成及特性比较

应用DEAE-纤维素和凝胶柱层析,分别将N_2和NU_1^+(30 mmol/L)培养的粪产碱菌固氮酶铁蛋白(Af2和Af^+2)分离并提纯52倍,在SDS-PAGE上呈均一状态。Af2的比活性达1540 nmol C_2H_4mg^(-1)protein min^(-1),Af~*2无活性。Af2和Af~*2理化性质基本相同,分子量为64.5 kD;均由2个亚基组成,每个亚基分子量为32.5kD;氨基酸种类相同,总残基数分别为537和553,不含色氨酸;每分子Af2和Af^+2均含有4个Fe原子和4个酸不稳定S^(2-)原子;UV-vis光谱吸收特征相同;荧光探剂测定结果为:每分于Af2和Af~*2均络合2个分子MgATP或2个分子MgADP。

固氮粪产碱菌ntrC-lacZ融合基因的构建及其在水稻根部的表达

将粪产碱菌（Alcaligenesfaecalis）A1501ntrC基因和lacZ基因正向克隆于广泛性转移载体pLA2917上，获得多拷贝ntrC质粒pLAC1和含ntrC－lacZ融合基因的重组质粒pLAC2，采用双亲结合方法，将上述两个重组质粒导入A1501中，获得含ntrC－lacZ融合基因的结合子A15C2和ntrC多拷贝结合子A15C1。采用X－gal原位显色技术、显微切片、扫描电镜观察及ntrC部分缺失突变株研究粪产碱菌ntrC在根部的表达及功能，结果表明粪产碱菌A1501在水稻根部有较强的定殖能力，并能侵进入水稻根内定殖。在水稻主侧根伸长区及根内皮层薄壁细胞及侧根分生区ntrC－lacZ融合基因表达活性明显高于别的部位。高铵条件下多拷贝ntrC结合子根表定殖能力大于野生型，而ntrC突变株则低于野生型。表明ntrC基因参与固氮菌根表结合的过程。

粪产碱菌对阿魏酸厌氧降解的影响

粪产碱菌在以阿魏酸为唯一碳源的厌氧发酵中培养7 d,阿魏酸的降解率约为70%;研究秸秆厌氧发酵产气(以产气量反应菌群的活性)发现,体系接种5%粪产碱菌后,菌群的活性最强,生物气增量最大,达130 m L,比接种3%和7%粪产碱菌的体系提高85.71%和116.67%;同时体系的产酸效率和阿魏酸的降解率均显著提升,分别比接种3%和7%粪产碱菌的体系提高136%和110.71%以及25%和33.33%。傅里叶红外光谱检测表明:厌氧发酵体系接种5%粪产碱菌后秸秆中木质素、阿魏酸的特征官能团结构被有效破坏。秸秆厌氧发酵体系接入粪产碱菌可以有效降解阿魏酸等木质素降解衍生物、解除木质素及其降解产物对厌氧菌群的毒性同时提高产气效率,具有应用价值。

粪产碱菌JQBF100降解酚氰废水的研究

焦化废水中含有大量酚类与氰化物,由于成分复杂使得污水修复处理难度提高。利用广西北部湾海泥的粪产碱菌JQBF100进行降解氰化物和苯酚的研究,结果表明,JQBF100单独降解苯酚存在停滞期;在酚氰混合体系中,菌株可在无其他C、N源的无机盐溶液中降解初始酚氰质量浓度比为1 000∶100和500∶500的体系;无机氰化物优先被降解且不受苯酚影响,且氰化物的存在可缩短菌株降解苯酚的停滞期。苯酚与CN-产物甲酸的降解相互有抑制作用,但苯酚随着甲酸的降解开始降解。