粪肠球菌ace阳性和阴性菌株体外生物被膜形成能力比较

目的比较粪肠球菌ace基因阳性、阴性菌株的生物被膜形成能力,探讨粪肠球菌ace基因是否有利于细菌生物被膜的形成。方法微量滴定板法检测46株临床分离粪肠球菌的生物膜形成能力,PCR方法检测其ace基因,比较生物膜阳性组、阴性组粪肠球菌ace基因检出率;将粪肠球菌ATCC29212(ace^+)、野生株U8-ace^-、空质粒对照株EU8-ace^-、转化株ZU8-ace^+接种到96孔板,培养3h、6h、12h、24h、36h、48h,结晶紫染色,测定OD570,微量滴定板法比较ATCC29212(ace^+)、U8-ace^-、EU8-ace^-以及ZU8-ace^+的生物被膜形成能力;将ATCC29212(ace^+)、U8-ace^-、EU8-ace^-、ZU8-ace^+在含盖玻片的细胞培养皿内培养6h^72h,共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察比较ace^+、ace^-粪肠球菌形成的生物膜平均厚度和密度。结果生物膜阳性组粪肠球菌ace基因检出率为76.67%,高于生物膜阴性组31.25%的检出率,差别有统计学意义(χ^2=9.04,P>0.05);微量滴定板法显示不同时间点ATCC29212(ace^+)以及转化株ZU8-ace^+的OD570值都大于U8-ace^-的OD570值,P<0.01,而EU8-ace^-与U8-ace^-比较,OD570值无统计学差别,P>0.05;CLSM观测的ace^+粪肠球菌在不同阶段所形成的生物膜的平均厚度、密度均高于ace^-粪肠球菌,P<0.01,空质粒对照株与野生株比较,生物膜的厚度、密度无统计学差别,P>0.05。结论粪肠球菌胶原黏附素ace基因或有利于肠球菌生物被膜的形成。

粪肠球菌ace基因缺失突变株的构建

本研究旨在构建粪肠球菌胶原蛋白黏附素基因(ace)缺失突变株,为进一步探讨该基因编码的毒力因子Ace的功能奠定基础。利用pK18mobSacB质粒作为基因敲除载体,构建粪肠球菌ace基因重组自杀质粒pK001,通过体内同源重组筛选成功敲除ace基因的突变株,然后对突变株细菌黏附体外培养猪肠上皮细胞IPEC-J2及其细菌生物被膜形成的情况进行了检测。结果显示,同源重组后,经过卡那霉素抗性筛选、PCR及Southern blot鉴定,成功获得了ace基因缺失突变株肠球菌△ace。细菌生长曲线测定试验表明,ace基因敲除对细菌的生长繁殖并无明显影响,但体外生物被膜测定试验显示基因缺失突变株肠球菌△ace的生物被膜形成能力有所降低。本研究证实了毒力因子Ace对猪源粪肠球菌与宿主黏附的重要作用,该基因缺失突变株的构建为进一步的理论研究和疫苗研发奠定基础。