人精子蛋白17单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗精子蛋白17(Sp17)的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:克隆人Sp17cDNA,表达带有6His标记的重组Sp17,用纯化的重组Sp17免疫BALB/c小鼠制备mAb。用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆。用免疫组化染色法及阻断试验鉴定mAb的特异性。结果:获得2株杂交瘤细胞系3C12和3D6,其分泌的mAb的Ig亚类(型)分别为IgG1和IgM(κ),杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32;腹水mAb的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。用人和大鼠睾丸组织以及人精液精子免疫组化染色及阻断试验证明,抗Sp17mAb具有良好的特异性。抗Sp17mAb也可识别卵巢癌组织中异常表达的Sp17。结论:成功地制备特异性的抗Sp17mAb,为研究该蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础。

精子蛋白sp32/OY-TES-1 mRNA及其蛋白在正常组织表达的探讨

目的了解正常组织中sp32/OY-TES-1 mRNA的表达量是否存在差异以及该蛋白的表达情况,为sp32/OY-TES-1表达谱增加更多信息。方法提取40例(19种)正常组织总RNA,逆转录-聚合酶合成cDNA,普通PCR检测cDNA质量;构建目的基因sp32/OY-FES-1及看家基因HPRT质粒,制备标准品,绘制标准曲线,建立实时定量PCR(TaqMan)方法和优化反应体系,检测组织中sp32/OY-TES-1和HPRT的表达,sp32/OY-TES-1 mRNA的表达量以OY-TES-1/HPRT表示。通过制备的OY-TES-1多克隆抗体,结合免疫组织化学检测sp32/OY-TES-1蛋白在多种正常组织中的表达。结果正常组织中sp32/OY-TES-1 mRNA阳性率为72.50%(29/40);2.非睾丸正常组织中sp32/OY-TES-1 mRNA的相对表达量值(目的基因/看家基因)为0.0001～0.4950,呈对数正态分布;3.睾丸组织中sp32/OY-TES-1 mRNA的相对表达量为44.9,是其他正常组织的91～1000倍;4.免疫组织化学(IHC)显示在所检测的多种正常组织和细胞中(10例睾丸组织、8例结肠、7例肝、6例骨骼肌、5例胃、5例晶状体、4例精子、3例外周血白细胞和1例肾),除4例精子和1例肾组织中的肾小管外,其余均未见OY-TES-1蛋白阳性反应。结论sp32/OY-TES-1 mRNA广泛地表达在各种正常组织,表达量因组织不同而异;睾丸组织是所检测的正常组织中其mRNA表达量最高的组织。而sp32/OY-TES-1蛋白比其mRNA更具有限制性表达的特点。

精子蛋白Sp32/OY-TES-1基因mRNA表达的探讨

目的了解精子蛋白Sp32/OY-TES-1基因mRNA的表达特点,研制癌-睾丸抗原(CTA)的肿瘤疫苗。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测95例正常人组织及125例人肿瘤组织中Sp32/OY-TES-1mRNA的表达,随机选取RT-PCR阳性产物12份进行DNA测序;对所得数据进行统计学分析。结果Sp32/OY-TES-1在正常和肿瘤组织中的表达频率分别为68.4%(65/95)和44.00%(55/125),两者比较有统计学意义(P<0.05)。在24种不同器官的正常组织中,21种表达Sp32/OY-TES-1基因mRNA(87.50%)。DNA测序结果证实,RT-PCR产物为Sp32/OY-TES-1基因。结论Sp32/OY-TES-1基因的mRNA在正常组织中广泛表达,它是否可归为睾丸和肿瘤限制性表达的基因尚需进一步研究。

精子蛋白17mRNA在卵巢癌中的表达及临床意义

目的:测定精子蛋白(Sp)17mRNA在肿瘤组织中表达情况。方法:设计合成特异性引物,建立测定人Sp17mRNA的RTPCR的方法,以β肌动蛋白(βactin)作为内标。检测13份原发卵巢癌组织标本、3份卵巢癌腹水标本和13份其他肿瘤组织标本。用正常睾丸组织RNA作模板进行RTPCR作为阳性对照,正常卵巢组织为阴性对照。阳性对照可出现2个条带,其中Sp17扩增产物近500bp,βactin产物234bp。阴性对照仅出现βactin条带。结果:13份原发卵巢癌组织标本中,11例表达Sp17mRNA,阳性率为84.6%。3份卵巢癌腹水标本中,1份检出Sp17mRNA。其他肿瘤组织标本全部阴性。结论:Sp17mRNA在原发卵巢恶性肿瘤中高水平表达,可以作为临床诊断的辅助指标。

血清顶体蛋白酶抗体与精子蛋白17抗体对不孕不育症的临床价值探讨

目的探讨血清顶体蛋白酶抗体(AcrAb)与精子蛋白17抗体(Sp17Ab)对不孕不育的影响及意义。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测60例不明原因不孕不育症患者及48名正常生育者(对照组)血清AcrAb、SP17Ab,采用t检验和直线相关分析进行统计。结果不明原因不孕不育症组男性及女性血清AcrAb分别为(22.39±3.15)、(21.02±3.56)U/L,均明显高于对照组男、女性[(11.29±2.15)、(10.23±2.12)U/L,P<0.01];不明原因不孕不育症组男性及女性血清Sp17Ab分别为(10.47±2.10)、(9.63±2.04)U/L,均高于对照组男、女性[(3.63±1.05)、(3.58±1.03)U/L,P<0.01];男性及女性血清AcrAb和Sp17Ab之间均无相关性[相关系数(r)分别为0.17、-0.20,P均>0.05]。结论不明原因不孕不育症患者血清AcrAb及Sp17Ab含量明显高于正常人,且相互独立,可单独或联合检测作为不孕不育症的辅助诊断指标。

子宫内膜癌和宫颈癌中CT抗原精子蛋白17的异常表达

目的人精子蛋白17(spermprotein17,Sp17)正常情况下局限表达于睾丸,近年发现在上皮性卵巢癌等恶性肿瘤中异常表达,已被列入CT(cancer/testis)抗原家族。我们研究该蛋白在不同病理类型的子宫内膜癌和宫颈癌中的表达频度、分布类型以及与肿瘤临床分期分级的关系,旨在探讨Sp17是否可能成为相关妇科肿瘤诊断标志和治疗靶标。方法用免疫组化技术检测81例石蜡包埋的妇科恶性肿瘤组织标本中Sp17的表达,其中包括50例子宫内膜癌(腺癌44例、腺鳞癌6例)和31例宫颈癌(鳞癌17例、腺癌14例)。结果子宫内膜癌组织Sp17的阳性率为66%(33/50),其中腺癌29例阳性,腺鳞癌4例阳性,表达模式呈异质性,Sp17表达与肿瘤分化程度和临床分期均无相关性。宫颈癌组织Sp17总阳性率32.2%(10/31),鳞癌23.5%(4/17),腺癌42.8%(6/14)。结论Sp17在子宫内膜癌和宫颈腺癌中呈高水平异常表达,尽管其表达与肿瘤分化程度和临床分期无明显相关,仍有可能作为肿瘤体内显像诊断和免疫治疗的分子靶标。

附睾精子蛋白P34H与男性生殖

哺乳动物精子在附睾转运过程中会获得精 卵相互作用所必需的精子表面蛋白。P34H是由人附睾上皮细胞分泌并定位于精子顶体的精子膜蛋白 ,属于短链脱氢酶 还原酶 (SDR)超家族成员。初步研究表明 ,P34H能够介导精子 卵透明带的结合 ,可作为附睾精子成熟的标志物 ,且低水平的附睾精子蛋白P34H与原发性男性不育显著相关。因此 ,精子表面P34H的水平可以作为男性不育症的一个辅助诊断指标。本文对附睾精子蛋白P34H的分子生物学特性、基因的表达与调控。

小鼠精子蛋白Sp17的克隆、表达及其免疫原性研究

目的获得鼠精子蛋白Sp17基因,构建重组表达载体并实现其在大肠杆菌中的高效表达,为制备免疫性避孕疫苗奠定基础。方法提取BALB/c小鼠睾丸组织总RNA,通过RT-PCR扩增Sp17基因全长cDNA序列,并将其克隆至pMD 18-T质粒载体中,再经HindⅢ/XhoⅠ双酶切将Sp17基因片段亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot对表达产物进行初步鉴定,并检测重组蛋白Sp17免疫小鼠后血清特异抗体滴度。结果获得了小鼠Sp17的全长cDNA,成功构建了重组原核表达载体pET/Sp17,在IPTG的诱导下实现了目的蛋白在大肠杆菌中的高效表达,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体。结论小鼠精子蛋白Sp17基因序列已被克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效、正确的表达,重组蛋白Sp17能够诱导产生特异性免疫反应,具有一定程度的免疫原性。

人精子蛋白17基因在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人精子蛋白17(hSp17)基因,构建重组表达载体并表达重组蛋白.方法:用RTPCR法从人睾丸中克隆hSp17基因,构建重组表达质粒pET28a(+)/hSp17,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE检测,用特异性hSp17的mAb进行Westernblot鉴定,NiNTAHisBind树脂纯化重组蛋白.结果:克隆到hSp17cDNA(456bp)并经过DNA测序证实,表达和纯化得到重组蛋白hSp17(表观Mr为27500),并经过Westernblot鉴定.结论:成功克隆和表达hSp17基因.

不育患者血清精子蛋白17抗体的检测及临床意义

目的:检测抗精子抗体(AsAb)阳性不育患者血清中抗精子蛋白17(Sp17)的抗体,探讨该抗体在免疫性不育血清学诊断和免疫避孕方面的潜在应用价值。方法:用重组人Sp17作为抗原,ELISA法检测62例AsAb阳性血清中Sp17抗体阳性率及滴度,分析AsAb中抗Sp17的含量。结果:AsAb阳性血清中Sp17抗体阳性率为56.5%,男女之间差异无显著性。Sp17抗体占AsAb的(10.09±7.45)%,结果具有统计学意义(P<0.05)。结论:Sp17是重要的精子抗原组分,血清中Sp17抗体的检测可作为不育患者辅助诊断指标,同时也提示Sp17可能是一种免疫避孕候选抗原疫苗。

精子蛋白17抗体免疫磁性颗粒活性分析及细胞成像研究

目的:制备精子蛋白17(Sp17)抗体免疫磁性纳米颗粒,以期用于卵巢癌的磁共振成像靶向诊断。方法:在偶联剂EDC/NHS作用下,将壳聚糖修饰磁性氧化铁纳米颗粒与抗人Sp17抗体结合,制备抗Sp17抗体免疫磁性纳米颗粒(IMNPs)。透射电镜观察颗粒的形貌特征,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳评价抗体与磁性颗粒的结合效果,ELISA检测免疫磁性颗粒的免疫活性。将IMNPs与转染人Sp17的卵巢癌HO-8910细胞共孵育,进行体外磁共振成像检测。结果:成功实现了抗体与磁性纳米颗粒的偶联,并且IMNPs保持良好的抗体活性。磁共振显示该颗粒成功靶向Sp17阳性的细胞,没有发生明显的非特异吸附。结论:该免疫磁性纳米颗粒特异性良好,可进一步用作卵巢癌的靶向治疗研究。

人精子蛋白17增强型绿色荧光蛋白共表达卵巢癌细胞模型的建立

目的:建立人精子蛋白17(hSp17)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的卵巢癌细胞模型。方法:用PCR方法获取hSp17基因片段,HindⅢ/KpnⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接的方法将hSp17基因片段克隆至含报告基因EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,荧光倒置显微镜观察及Westernblot检测转染细胞中hSp17/EGFP融合蛋白的表达,G418筛选稳定表达的细胞株。结果:酶切和测序结果均证实pEGFP-N1/hSp17重组质粒的构建完全正确。荧光观察与Western blot均证实了hSp17/EGFP蛋白的共表达,且成功筛选出稳定表达的细胞株。结论:成功构建hSp17/EGFP共表达的卵巢癌细胞模型,为研究hSp17异常表达对肿瘤细胞生物学行为的影响,以及hSp17为靶标的肿瘤诊断和生物治疗奠定基础。

雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫精子蛋白组份的比较研究

对雌核发育银鲫和两性融合彩鲫精子蛋白组份进行了比较分析。通过分级抽提得到精子的不同组份精浆、精头的膜、鞭毛和脱膜精头等 ,然后经不同的凝胶电泳系统 ,比较分析了银鲫精子和其两性亲缘种彩鲫精子相应组份可溶性蛋白成份的差异。研究表明 ,经分级抽提的银鲫精子和彩鲫精子的各个组份都含有其特定的蛋白谱带。精浆蛋白在两种鱼之间和两种鱼的不同个体之间都存在一定差异。精头膜、鞭毛和脱膜精头的可溶性蛋白在同种鱼不同个体间高度一致 ,但在两种鱼之间表现出差异。两种鱼精头膜的可溶性蛋白在SDS PAGE电泳图谱上基本一致 ,而在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上则具有各自的特征性谱带。鞭毛可溶性蛋白的SDS PAGE分析在雌核发育银鲫中揭示出一条特异的蛋白带。脱膜精头的可溶性蛋白在SDS PAGE电泳图谱上差异明显 ,存在几条特征性蛋白带 ,并经Acid UreaPAGE系统分析 ,证实这些特征性蛋白为碱性蛋白。这些发现为进一步鉴定雌核发育银鲫雄鱼精子的特异性蛋白和揭示其分子机制打下了基础。

精子蛋白17的研究进展

精子蛋白 17(Sp17)为一种睾丸组织特异性蛋白 ,参与精子的顶体反应。然而 ,近年来发现Sp17在正常非睾丸组织和肿瘤组织也有表达。它作为一种免疫避孕的候选抗原以及肿瘤免疫治疗的理想靶分子倍受关注。本文就Sp17的特性、表达与分布、生理学功能及临床研究的新进展进行了综述。

精子蛋白17异常表达增强卵巢癌细胞HO-8910迁移性

目的:探讨精子蛋白17(sperm protein 17,Sp17)异常表达对人卵巢癌细胞HO-8910迁移性的影响。方法:应用脂质体转染法将携带Sp17和增强型绿色荧光蛋白基因的重组质粒pEGFP-Sp17转染卵巢癌细胞HO-8910,RT-PCR及Western印迹法检测Sp17的表达情况;用Transwell小室法检测细胞迁移能力的改变。结果:重组质粒pEGFP-Sp17转染HO-8910细胞后,Sp17与EGFP以融合蛋白形式表达;重组质粒转染组与空载体转染组发生迁移的细胞数分别为(156.6±14.9)个/高倍视野和(39.3±8.53)个/高倍视野,差异具有显著性意义(P<0.05)。结论:Sp17基因异常表达明显增强卵巢癌细胞HO-8910迁移能力。

精子蛋白17靶向的小鼠肿瘤近红外荧光成像

目的人精子蛋白17(human sperm protein 17,Sp17)异常表达在一些恶性肿瘤细胞,可被用作肿瘤特异性分子诊断和治疗的靶点。文中将抗Sp17单克隆抗体与近红外染料偶联,制成高亲和力探针,用近红外成像技术对活体动物肿瘤靶点进行确认。方法用免疫组化技术证明,Sp17在肝细胞癌细胞系SMMC-7721及裸鼠皮下移植瘤组织高水平异常表达。将近红外染料吲哚花箐素衍生物(ICG-Der-02)与抗Sp17单克隆抗体(anti-Sp17 mAb)偶联,获得特异性探针。静脉注射至荷瘤小鼠体内,用光学成像系统进行活体实时肿瘤显像。结果 anti-Sp17-ICG-Der-02探针进入动物体内后,快速聚集到肿瘤部位,发出强烈的荧光信号。随着未结合染料逐渐排出体外,动物肝、肾等内脏器官的非特异荧光信号消褪,清晰显示出肿瘤的部位及大小,且可以持续至少7d。结论高亲和力探针anti-Sp17-ICG-Der-02对体内肿瘤特异性诊断有潜在应用价值。

人细胞核自身抗原精子蛋白的重组表达及多克隆抗体制备

目的:获得纯化的人细胞核自身抗原精子蛋白(hNASP)及其多克隆抗体,为其功能研究做准备。方法:提取人睾丸组织总RNA,用自行设计的引物,PCR扩增hNASP的一段序列,PCR产物经TA克隆后,通过BamHⅠ和HindⅢ双酶切克隆到pET-28 a(+)中。在E.coliBL21中,用异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达H is融合蛋白。样品超声处理后,经镍离子亲和树脂进行亲和层析纯化。用纯化的重组蛋白免疫家兔获取多克隆抗体。结果:对表达重组蛋白的质粒进行DNA测序以及表达的重组蛋白经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,证实获取了目的蛋白。ELISA证实免疫家兔后获得高效价的抗体。结论:用上述原核生物表达的方法可以得到纯化的hNASP蛋白,用纯化的蛋白免疫家兔也能获得高效价的抗体。

从噬菌体展示肽库中筛选与人精子蛋白17结合的短肽序列

目的:随机从噬菌体12肽库中筛选与人精子蛋白17(Sp17)特异性结合的短肽序列,并进行鉴定。方法:以基因工程制备的人Sp17为钓饵蛋白,采用亲和淘筛法对噬菌体肽库进行三轮亲和淘筛。富集Sp17特异结合噬菌体,用ELISA鉴定其结合活性并进行DNA测序分析。结果:随机挑出20个噬菌体克隆进行鉴定,ELISA显示其中5个克隆与Sp17有较强结合活性,其氨基酸序列分别为QLMSNIHRRM II、RKMMNQTKRHLP、NTMKTMR IMMTR、RRRLLLMQRRMKR和SPRPMMRR IRKQ。结论:从噬菌体展示肽库中筛选鉴定出5个与人Sp17结合的12肽序列。

精索静脉曲张不育患者精子蛋白组双向电泳技术的建立与优化

目的:建立与优化精索静脉曲张不育患者精子蛋白质组双向凝胶电泳技术。方法:采取Percoll密度梯度离心法提取精索静脉曲张不育患者精子,比较不同精子蛋白样品制备方法、不同胶条、不同上样量和不同水化方式对双向凝胶电泳结果的影响。结果:使用clean-up kit法对样品进行预处理,选取pH 5～8的固相化pH梯度胶条,采用250μg的上样量和主动水化方式能获得背景干净、分辨率高的双向电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)图谱。结论:成功建立了精索静脉曲张不育患者精子蛋白双向凝胶电泳平台,所获2-DE图谱的分辨率高、重复性好,为进一步探讨精索静脉曲张导致不育的分子机制奠定了技术基础。