小鼠精子Sp17与IL-5融合蛋白的构建、表达及其免疫原性鉴定

目的构建和表达小鼠精子蛋白Sp17与白介素5(IL-5)融合蛋白,并对其进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR技术从质粒pGEM-1-IL-5中扩增IL-5基因片段,将其克隆至pET/Sp17原核表达载体中与Sp17基因融合,构建重组质粒pET/Sp17-IL-5,经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni2+-NTAAgarose纯化,SDS-PAGE检测、N端测序及Western blot;重组蛋白Sp17-IL-5免疫小鼠后ELISA检测小鼠血清特异性抗体。结果成功构建小鼠精子蛋白Sp17与IL-5融合蛋白的高效表达质粒pET/Sp17-IL-5,重组工程菌pET-28a(+)-Sp17-IL-5/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白相对分子量(Mr)约39000,纯化后蛋白纯度达91%,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体。结论Sp17-IL-5蛋白经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性,为新型Sp17避孕疫苗的研制奠定基础。

人精子蛋白SP17基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :获得人精子蛋白SP17基因 (hSP17) ,构建重组表达载体并在大肠杆菌中表达。方法 :获取人睾丸组织 ,提取总RNA ,通过RT -PCR获得hSP17的全长cDNA ;将该cDNA克隆入TA载体 ,并亚克隆进融合蛋白型重组表达载体pGEX - 3b ;转化大肠杆菌DH5α并诱导表达之。结果 :获得了全长hSP17的cDNA ,构建了重组表达子hSP17/pGEX - 3b ,获得了预期大小的融合蛋白hSP17-GST的表达。结论 :通过构建重组表达质粒hSP17/pGEX并转化大肠杆菌 ,获得了融合蛋白hSP17-GST的高效表达。

人精子蛋白17单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗精子蛋白17(Sp17)的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:克隆人Sp17cDNA,表达带有6His标记的重组Sp17,用纯化的重组Sp17免疫BALB/c小鼠制备mAb。用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆。用免疫组化染色法及阻断试验鉴定mAb的特异性。结果:获得2株杂交瘤细胞系3C12和3D6,其分泌的mAb的Ig亚类(型)分别为IgG1和IgM(κ),杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32;腹水mAb的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。用人和大鼠睾丸组织以及人精液精子免疫组化染色及阻断试验证明,抗Sp17mAb具有良好的特异性。抗Sp17mAb也可识别卵巢癌组织中异常表达的Sp17。结论:成功地制备特异性的抗Sp17mAb,为研究该蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础。

血清顶体蛋白酶抗体与精子蛋白17抗体对不孕不育症的临床价值探讨

目的探讨血清顶体蛋白酶抗体(AcrAb)与精子蛋白17抗体(Sp17Ab)对不孕不育的影响及意义。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测60例不明原因不孕不育症患者及48名正常生育者(对照组)血清AcrAb、SP17Ab,采用t检验和直线相关分析进行统计。结果不明原因不孕不育症组男性及女性血清AcrAb分别为(22.39±3.15)、(21.02±3.56)U/L,均明显高于对照组男、女性[(11.29±2.15)、(10.23±2.12)U/L,P<0.01];不明原因不孕不育症组男性及女性血清Sp17Ab分别为(10.47±2.10)、(9.63±2.04)U/L,均高于对照组男、女性[(3.63±1.05)、(3.58±1.03)U/L,P<0.01];男性及女性血清AcrAb和Sp17Ab之间均无相关性[相关系数(r)分别为0.17、-0.20,P均>0.05]。结论不明原因不孕不育症患者血清AcrAb及Sp17Ab含量明显高于正常人,且相互独立,可单独或联合检测作为不孕不育症的辅助诊断指标。

精子蛋白17mRNA在卵巢癌中的表达及临床意义

目的:测定精子蛋白(Sp)17mRNA在肿瘤组织中表达情况。方法:设计合成特异性引物,建立测定人Sp17mRNA的RTPCR的方法,以β肌动蛋白(βactin)作为内标。检测13份原发卵巢癌组织标本、3份卵巢癌腹水标本和13份其他肿瘤组织标本。用正常睾丸组织RNA作模板进行RTPCR作为阳性对照,正常卵巢组织为阴性对照。阳性对照可出现2个条带,其中Sp17扩增产物近500bp,βactin产物234bp。阴性对照仅出现βactin条带。结果:13份原发卵巢癌组织标本中,11例表达Sp17mRNA,阳性率为84.6%。3份卵巢癌腹水标本中,1份检出Sp17mRNA。其他肿瘤组织标本全部阴性。结论:Sp17mRNA在原发卵巢恶性肿瘤中高水平表达,可以作为临床诊断的辅助指标。

子宫内膜癌和宫颈癌中CT抗原精子蛋白17的异常表达

目的人精子蛋白17(spermprotein17,Sp17)正常情况下局限表达于睾丸,近年发现在上皮性卵巢癌等恶性肿瘤中异常表达,已被列入CT(cancer/testis)抗原家族。我们研究该蛋白在不同病理类型的子宫内膜癌和宫颈癌中的表达频度、分布类型以及与肿瘤临床分期分级的关系,旨在探讨Sp17是否可能成为相关妇科肿瘤诊断标志和治疗靶标。方法用免疫组化技术检测81例石蜡包埋的妇科恶性肿瘤组织标本中Sp17的表达,其中包括50例子宫内膜癌(腺癌44例、腺鳞癌6例)和31例宫颈癌(鳞癌17例、腺癌14例)。结果子宫内膜癌组织Sp17的阳性率为66%(33/50),其中腺癌29例阳性,腺鳞癌4例阳性,表达模式呈异质性,Sp17表达与肿瘤分化程度和临床分期均无相关性。宫颈癌组织Sp17总阳性率32.2%(10/31),鳞癌23.5%(4/17),腺癌42.8%(6/14)。结论Sp17在子宫内膜癌和宫颈腺癌中呈高水平异常表达,尽管其表达与肿瘤分化程度和临床分期无明显相关,仍有可能作为肿瘤体内显像诊断和免疫治疗的分子靶标。

人精子蛋白17基因在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人精子蛋白17(hSp17)基因,构建重组表达载体并表达重组蛋白.方法:用RTPCR法从人睾丸中克隆hSp17基因,构建重组表达质粒pET28a(+)/hSp17,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE检测,用特异性hSp17的mAb进行Westernblot鉴定,NiNTAHisBind树脂纯化重组蛋白.结果:克隆到hSp17cDNA(456bp)并经过DNA测序证实,表达和纯化得到重组蛋白hSp17(表观Mr为27500),并经过Westernblot鉴定.结论:成功克隆和表达hSp17基因.

不育患者血清精子蛋白17抗体的检测及临床意义

目的:检测抗精子抗体(AsAb)阳性不育患者血清中抗精子蛋白17(Sp17)的抗体,探讨该抗体在免疫性不育血清学诊断和免疫避孕方面的潜在应用价值。方法:用重组人Sp17作为抗原,ELISA法检测62例AsAb阳性血清中Sp17抗体阳性率及滴度,分析AsAb中抗Sp17的含量。结果:AsAb阳性血清中Sp17抗体阳性率为56.5%,男女之间差异无显著性。Sp17抗体占AsAb的(10.09±7.45)%,结果具有统计学意义(P<0.05)。结论:Sp17是重要的精子抗原组分,血清中Sp17抗体的检测可作为不育患者辅助诊断指标,同时也提示Sp17可能是一种免疫避孕候选抗原疫苗。

精子蛋白17抗体免疫磁性颗粒活性分析及细胞成像研究

目的:制备精子蛋白17(Sp17)抗体免疫磁性纳米颗粒,以期用于卵巢癌的磁共振成像靶向诊断。方法:在偶联剂EDC/NHS作用下,将壳聚糖修饰磁性氧化铁纳米颗粒与抗人Sp17抗体结合,制备抗Sp17抗体免疫磁性纳米颗粒(IMNPs)。透射电镜观察颗粒的形貌特征,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳评价抗体与磁性颗粒的结合效果,ELISA检测免疫磁性颗粒的免疫活性。将IMNPs与转染人Sp17的卵巢癌HO-8910细胞共孵育,进行体外磁共振成像检测。结果:成功实现了抗体与磁性纳米颗粒的偶联,并且IMNPs保持良好的抗体活性。磁共振显示该颗粒成功靶向Sp17阳性的细胞,没有发生明显的非特异吸附。结论:该免疫磁性纳米颗粒特异性良好,可进一步用作卵巢癌的靶向治疗研究。

人精子蛋白17增强型绿色荧光蛋白共表达卵巢癌细胞模型的建立

目的:建立人精子蛋白17(hSp17)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的卵巢癌细胞模型。方法:用PCR方法获取hSp17基因片段,HindⅢ/KpnⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接的方法将hSp17基因片段克隆至含报告基因EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,荧光倒置显微镜观察及Westernblot检测转染细胞中hSp17/EGFP融合蛋白的表达,G418筛选稳定表达的细胞株。结果:酶切和测序结果均证实pEGFP-N1/hSp17重组质粒的构建完全正确。荧光观察与Western blot均证实了hSp17/EGFP蛋白的共表达,且成功筛选出稳定表达的细胞株。结论:成功构建hSp17/EGFP共表达的卵巢癌细胞模型,为研究hSp17异常表达对肿瘤细胞生物学行为的影响,以及hSp17为靶标的肿瘤诊断和生物治疗奠定基础。

精子蛋白17的研究进展

精子蛋白 17(Sp17)为一种睾丸组织特异性蛋白 ,参与精子的顶体反应。然而 ,近年来发现Sp17在正常非睾丸组织和肿瘤组织也有表达。它作为一种免疫避孕的候选抗原以及肿瘤免疫治疗的理想靶分子倍受关注。本文就Sp17的特性、表达与分布、生理学功能及临床研究的新进展进行了综述。

精子蛋白17异常表达增强卵巢癌细胞HO-8910迁移性

目的:探讨精子蛋白17(sperm protein 17,Sp17)异常表达对人卵巢癌细胞HO-8910迁移性的影响。方法:应用脂质体转染法将携带Sp17和增强型绿色荧光蛋白基因的重组质粒pEGFP-Sp17转染卵巢癌细胞HO-8910,RT-PCR及Western印迹法检测Sp17的表达情况;用Transwell小室法检测细胞迁移能力的改变。结果:重组质粒pEGFP-Sp17转染HO-8910细胞后,Sp17与EGFP以融合蛋白形式表达;重组质粒转染组与空载体转染组发生迁移的细胞数分别为(156.6±14.9)个/高倍视野和(39.3±8.53)个/高倍视野,差异具有显著性意义(P<0.05)。结论:Sp17基因异常表达明显增强卵巢癌细胞HO-8910迁移能力。

精子蛋白17靶向的小鼠肿瘤近红外荧光成像

目的人精子蛋白17(human sperm protein 17,Sp17)异常表达在一些恶性肿瘤细胞,可被用作肿瘤特异性分子诊断和治疗的靶点。文中将抗Sp17单克隆抗体与近红外染料偶联,制成高亲和力探针,用近红外成像技术对活体动物肿瘤靶点进行确认。方法用免疫组化技术证明,Sp17在肝细胞癌细胞系SMMC-7721及裸鼠皮下移植瘤组织高水平异常表达。将近红外染料吲哚花箐素衍生物(ICG-Der-02)与抗Sp17单克隆抗体(anti-Sp17 mAb)偶联,获得特异性探针。静脉注射至荷瘤小鼠体内,用光学成像系统进行活体实时肿瘤显像。结果 anti-Sp17-ICG-Der-02探针进入动物体内后,快速聚集到肿瘤部位,发出强烈的荧光信号。随着未结合染料逐渐排出体外,动物肝、肾等内脏器官的非特异荧光信号消褪,清晰显示出肿瘤的部位及大小,且可以持续至少7d。结论高亲和力探针anti-Sp17-ICG-Der-02对体内肿瘤特异性诊断有潜在应用价值。

从噬菌体展示肽库中筛选与人精子蛋白17结合的短肽序列

目的:随机从噬菌体12肽库中筛选与人精子蛋白17(Sp17)特异性结合的短肽序列,并进行鉴定。方法:以基因工程制备的人Sp17为钓饵蛋白,采用亲和淘筛法对噬菌体肽库进行三轮亲和淘筛。富集Sp17特异结合噬菌体,用ELISA鉴定其结合活性并进行DNA测序分析。结果:随机挑出20个噬菌体克隆进行鉴定,ELISA显示其中5个克隆与Sp17有较强结合活性,其氨基酸序列分别为QLMSNIHRRM II、RKMMNQTKRHLP、NTMKTMR IMMTR、RRRLLLMQRRMKR和SPRPMMRR IRKQ。结论:从噬菌体展示肽库中筛选鉴定出5个与人Sp17结合的12肽序列。

人精子蛋白17抗原肽的合成及其在抗精子抗体检测中的应用研究

目的:合成人精子蛋白17的线性B细胞表位肽(118-127aa),并以此为抗原建立抗精子抗体(AsAb)检测的ELISA方法。方法:用PS3全自动多肽合成仪合成人精子蛋白17抗原肽,并经反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定。该合成肽作为ELISA法的包被抗原来检测血清中的AsAb(IgG)。结果:合成了实验所需要的抗原性肽段,高效液相色谱法(HPLC)结果显示其纯度为95.5%。以该合成肽为抗原建立的检测AsAb(IgG)的间接ELISA方法,与商品化试剂盒相比符合率为93.3%。结论:所合成的人SP17抗原肽具有较好的抗原活性,可作为间接ELISA法的包被抗原用于抗精子抗体的检测。

人精子蛋白17放射诱导表达细胞模型的构建

目的:构建pEgr-Sp17重组质粒,并检测其在人卵巢癌细胞系HO8910中的辐射诱导表达,探索Egr-1基因调控序列辐射诱导下游基因表达的功能,建立放射诱导表达人精子蛋白Sp17的细胞模型。方法:用双酶切、粘端连接的方法构建含有辐射诱导特性的早期反应因子Egr-1和人Sp17基因的pEgr-Sp17重组质粒,利用脂质体介导其转染人HO8910细胞,用免疫细胞化学方法检测X线照射后被转染细胞中Sp17的表达。在确证Sp17能瞬时表达后,继续用含G418的RPMI1640培养基培养细胞,筛选稳定表达Sp17的细胞株。结果:测序结果和酶切鉴定均证实pEgr-Sp17重组质粒构建正确;免疫细胞化学试验表明pEgr-Sp17重组质粒转染的人HO8910细胞表达Sp17蛋白。结论:X线可诱导pEgr-Sp17重组质粒在人HO8910细胞中表达Sp17蛋白,构建了Sp17蛋白放射诱导表达的卵巢癌细胞模型。

检控蛋白Rad17在小鼠睾丸精子发生过程中的表达及其磷酸化变化

Rad17是细胞周期检控点信号转导过程中的一个关键检控蛋白,在DNA损伤检控和DNA复制检控中具有重要功能。但Rad17在细胞减数分裂中的检控作用还不是很清楚。因细胞减数分裂在睾丸组织中非常活跃,应用Western印迹检测Rad17在不同发育时期的小鼠睾丸组织中的表达及其磷酸化水平,并应用免疫组化的方法检测小鼠睾丸组织不同时期生殖细胞内Rad17的表达变化。结果显示Rad17在小鼠睾丸组织内高表达,而在肝、肾等组织中表达水平较低;Rad17在不同周龄的小鼠睾丸组织中均高水平表达,但在4周龄以后的小鼠睾丸组织中其磷酸化水平明显升高;免疫组化结果显示Rad17在精原细胞、精母细胞的细胞核中高表达,但在成熟精子细胞中消失。这些结果提示Rad17在小鼠睾丸生殖细胞减数分裂过程中也起重要检控作用。

人精子蛋白17放射免疫分析的临床应用

为了探讨人精子蛋白17(Sp17)放免分析的临床意义,用自建的Sp17放免分析方法,测定了正常人及部分癌症患者血清Sp17值。结果显示,卵巢癌、子宫内膜癌患者血清Sp17值分别为36.02±27.95μg/L,40.29±21.15μg/L,与对照组15.60±7.66μg/L相比,有显著性差异(P<0.01);而且部分卵巢癌、子宫内膜癌患者血清Sp17值明显升高。因此血清Sp17浓度的测定可能有助于卵巢癌、子宫内膜癌症等患者的诊断和治疗,值得进一步研究。

子宫颈鳞状上皮内病变组织中精子蛋白17甲基化表达情况及与临床特征的关系

目的检测子宫颈鳞状上皮内病变组织(cervical squamous intraepithelial lesion,SIL)与正常宫颈组织中精子蛋白17(sperm protein 17,Sp17)甲基化表达情况差异,探讨其与SIL临床特征的关系。方法回顾性选取2015年1月至2016年4月于内蒙古自治区包头市中心医院行SIL活检或手术60例患者的新鲜子宫颈组织为SIL组,根据病变类型将20例低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)患者设为LSIL组,将40例高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)患者设为HSIL组;同时按照随机数表法选取同期20例正常宫颈组织为正常组。提取SIL中的DNA,运用DNA酸性亚硫酸盐转化、PCR扩增及PCR测序方法检测Sp17在SIL与正常宫颈中CpG岛的甲基化差异性表达情况。结果Sp17在正常宫颈组织与宫颈鳞状上皮内病变组织中的去甲基化表达依次增加,差异有显著性(P<0.05)。Sp17在启动子区域的去甲基化表达数量随着子宫颈鳞状上皮内病变的临床病理分级的增加而增加,且各组间的表达,差异有显著性(P<0.05)。SIL组与对照组年龄、民族、吸烟、妊娠孕次、HPV感染、首次妊娠年龄比较,差异无显著性(P>0.05)。SIL组HPV感染患者与未感染患者的Sp17去甲基化表达情况比较,差异有显著性(P<0.05)。结论SP17的去甲基化表达在SIL组织中高于正常组织,且随着SIL病理分级的增加而表达量有所增长,可能与HPV感染存在某种关联。