猪SPACA4蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备

本研究旨在制备公猪精子顶体蛋白4(Sperm Acrosome Associated 4,SPACA4)的多克隆抗体(Polyclonal antibody,PAb),以期为揭示猪SPACA4蛋白参与精子受精过程的分子机制提供试验材料。从GeneBank上选取公猪SPACA4基因序列(登录号:NM_001177929.1)编码区,去掉信号肽与终止子,克隆至pET-SUMO表达载体并转化E.coli Rosstta(DE3)感受态细胞,经1 mol/L IPTG诱导表达及亲和层析纯化后获得重组SPACA4蛋白。将重组蛋白免疫小鼠制备SPACA4 PAb,使用间接ELISA检测抗体效价,并利用WesternBlot法验证SPACA4PAb对公猪精子天然蛋白的特异性。重组质粒pET-SUMO-SPACA4能被IPTG诱导表达,主要以包涵体形式存在,SUMO-SPACA4重组蛋白相对分子质量约为25 KDa,鼠源SPACA4PAb能特异性结合重组蛋白,最高效价为1:2048000。经WesternBlot法检测,SPACA4PAb能识别天然SPACA4蛋白。本研究利用原核表达系统成功制备出效价高、特异性好的公猪SPACA4PAb,并能应用于识别天然SPACA4蛋白,为SPACA4基因的功能和应用研究提供素材。

SPACA4基因在人和小鼠的表达及其生物信息学分析

目的 分析SPACA4在小鼠和人的表达特性.方法 本研究通过对小鼠SPACA4基因（mSPACA4）在4、9、18、35、54d和6月龄小鼠睾丸中的Affymetrix芯片杂交,结合RT-PCR实验和生物信息学软件,分析mSPACA4及其同源基因hSPACA4的表达特性.结果 芯片杂交结果显示,mSPACA4基因在小鼠35d睾丸中开始表达,半定量RT-PCR结果与之完全一致.RT-PCR结果还显示,mSPACA4和hSPACA4分别在8种小鼠组织和10种人组织中呈现睾丸特异性表达.生物信息学分析显示,亚细胞定位预测该基因是跨膜蛋白（34.8%）或质膜上（34.8%）表达.mSPACA4蛋白的信号肽剪切位点在第19～20个氨基酸之间,跨膜区在第2～20及101～126个氨基酸之间.结论 mSPACA4和hSPACA4均为睾丸特异性表达基因,mSPACA4特异性地在35d龄后的小鼠睾丸中表达,SPACA4具有作为男子避孕药的靶点进行研究的潜在价值.