精密肝切片技术在谷胱甘肽抗氯化镉肝毒性研究中的应用

为了解精密肝切片技术应用于毒物及药物代谢体外研究的可行性 ,利用精密肝切片技术 (PCLS) ,观察毒物氯化镉 (CdCl2 )的肝毒作用及谷胱甘肽 (GSH)的拮抗效应。于最适切片与培养条件下 ,观察CdCl20 1、0 5、2 5mmol L对肝切片活力、NO分泌的影响 ,及以CYP2E1、CYP3A4为代表的I相酶和UDPGT、GST为代表的II相酶活性的变化。同时观察GSH 2 0 ,4 0 ,8 0mmol L对CdCl2 肝毒作用的逆转效应。结果显示 ,CdCl2显著降低肝切片活力 ;在 2 5mmol L时 ,CYP含量和CYP3A4活性分别较对照组降低了 4 7 6 %、6 6 0 % ,UDPGT 1、UDPGT 2和GST分别比对照组下降了 5 0 0 %、35 6 %、2 2 6 % ;而CYP2E1活性比对照组升高了75 8%。GSH 2 0mmol L时 ,CYP含量、CYP2E1、CYP3A4和UDPGT 2活性等指标接近正常水平。上述结果重复 2～ 3次变化趋势一致。提示精密肝切片培养系统用于CdCl2 肝毒作用和GSH干预效应体外研究时 ,具有稳定性和敏感性的特点。

精密肝切片技术方法学的建立

目的 :建立一种新的肝脏体外研究手段———精密肝切片技术 ,摸索最佳培养条件。方法 :利用国产振荡切片机 ,制备肝切片 ,建立培养系统 ,以乳酸脱氢酶外漏、谷胱甘肽含量、噻唑蓝还原能力、蛋白含量为指标 ,观察切片厚度、培养液pH值及培养时间对肝切片活力的影响 ;观察抗氧化剂谷胱甘肽 (GSH)、阿魏酸钠 (SF)对CCl4 损伤肝切片活力的影响。结果 :切片厚度 30 0 μm ,培养液pH7.0时 ,肝切片在 4h内活力维持良好。GSH可恢复CCl4 所致肝切片多项指标的变化 ,SF也有一定逆转作用。结论 :精密肝切片技术可用于肝体外研究。切片厚度 30 0 μm ,培养液pH7.

醋氨酚所致精密肝切片损伤模型的建立及CYP2E1的调节作用

目的:利用精密肝切片(PCLS)技术,建立醋氨酚所致肝切片损伤的体外模型,并探讨CYP2E1活性变化对肝损伤的调节作用,为研究和筛选肝保护药物提供实验依据。方法:利用振荡切片机制备PCLS,建立培养系统。将终浓度为500μmol/L的醋氨酚分别与切片共孵育0、2、4、6h,测定培养基和切片中的谷胱甘肽S-转移酶(GST)和乳酸脱氢酶(LDH)活性。在体给予不同剂量(0.25、0.5、1.0g/kg)的CYP2E1诱导剂乙醇,每天一次,连续3d。末次给药8h后处死动物,取其肝脏制备PCLS,再与500μmol/L醋氨酚共同孵育6h,检测ALT和LDH漏出率。正常PCLS与不同浓度的二乙基二硫代氨基甲酸酯盐(DDTC,CYP2E1抑制剂)(5、10、20μmol/L)、500μmol/L醋氨酚共同孵育6h,检测ALT和LDH漏出率。结果:与常规培养组比较,醋氨酚孵育4、6h组的GST和LDH漏出率显著升高(P<0.01)。与醋氨酚模型对照组比较,乙醇中、大剂量组LDH漏出率和小、大剂量组ALT漏出率皆升高(P<0.01,P<0.05);DDTC各浓度组ALT漏出率则降低(P<0.05)。结论:PCLS与500μmol/L醋氨酚共孵育4h即能成功地建立体外肝切片损伤的模型。抑制CYP2E1活性可能对醋氨酚所致的肝损伤有保护作用,而上调CYP2E1活性则可能加重醋氨酚所致的肝损伤。

精密肝切片技术在药物研究中的应用

精密肝切片是近年来迅速得到广泛应用的一种体外研究方法。该技术是介于器官与细胞水平之间的体外培养技术,可包含肝组织内的所有类型的细胞,保存完好的组织结构。在一定的程度上模拟了体内的肝环境,有利于观察细胞基质和细胞间的相互作用和外源性物质的代谢情况,可同时观察代谢酶的区域性分布和肝脏中各类型细胞的相互作用。此外在毒理学方面可以通过检查培养基中酶含有量的变化,结合肝切片的病理变化和免疫组化等技术,研究肝毒性的特点和机制。本文对精密肝切片的特点及其在药物代谢、毒理学应用等方面进行综述,以供药物研究参考。

CCl4诱导的建鲤精密肝切片损伤模型的构建及CYP1A对肝损伤的影响

为了评价CYP1A在四氯化碳(CCl4)诱导的建鲤(Cyprinus carpio.Jian)急性肝损伤中的作用,利用精密肝切片(precision-cut liver slices,PCLS)技术,构建了CCl4诱导的建鲤精密肝切片体外损伤模型。研究中通过测定精密肝切片的增值活力、生化指标、肝组织中CYP1A的m RNA表达水平来探讨CYP1A对肝损伤的调节作用。研究结果显示,4~24 mmol·L^-1 CCl4作用4 h后,建鲤精密肝切片培养上清液的谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)含量升高,切片匀浆中和丙二醛(MDA)大量产生,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平下降,其中,浓度为12mmol·L^-1的CCl4,损伤4h,肝切片的活力维持在65%以上,可以作为造模的条件;75μmol·L^-1α-萘黄酮作用精密肝切片6h后,肝组织中CYP1A的m RNA表达被显著抑制,生化指标显著改善。研究结果表明,CYP1A与CCl4诱导的建鲤肝损伤关系密切,抑制CYP1A的表达可能对肝损伤有保护作用。

吲哚-3-原醇对乙醛所致精密肝切片中星状细胞活化的影响

目的利用精密肝切片(PCLS)技术,研究吲哚-3-原醇(I3C)对乙醛活化肝星状细胞(HSCs)的作用及其机制。方法将200～800μmol.L-1的I3C及700μmol.L-1乙醛与PCLS共同孵育6h,免疫组化法分析肝切片中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,并检测培养液中谷胱甘肽S-转移酶(GST)和乳酸脱氢酶(LDH)活性、转化生长因子-β1(TGF-β1)含量、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)及基质金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)表达量及组织丙二醛(MDA)和羟脯氨酸(Hyp)含量。结果200～800μmol.L-1I3C可不同程度的减少乙醛激活的HSCs,并可明显降低乙醛升高的培养液中GST、LDH活性和肝组织中MDA和Hyp含量(P<0.05或P<0.01),呈良好的浓度依赖性。I3C给药组与乙醛对照组比较,培养液中TGF-β1含量降低(P<0.01),MMP-1/TIMP-1蛋白表达比值升高(P<0.01)。结论I3C能有效拮抗乙醛所致的HSCs活化,其机制与降低细胞氧化应激和促进基质胶原降解有关。

精密肝切片中乙醛活化肝星状细胞模型的建立

目的:在精密肝切片中利用乙醛激活肝星状细胞,建立一种星状细胞激活的体外模型,为研究和筛选阻抑肝纤维化发生的药物奠定基础。方法:利用振荡切片机制备精密肝切片,建立培养系统。以700μmol·L-1乙醛孵育切片,培养0、2、4、6h,测定培养基和组织匀浆中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、乳酸脱氢酶(LDH)和羟脯氨酸(Hyp)含量,观察病理切片中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。结果:与0h相比,乙醛培养2、4、6h培养基的GST、LDH漏出量均显著升高(P<0.05)。切片组织Hyp含量6h较0h相比明显升高(P<0.05)。免疫组化片镜下可见4、6h有α-SMA阳性细胞表达,图像分析显示面积和阳性率较0h明显增加(P<0.05)。结论:精密肝切片与终浓度为700μmol·L-1乙醛共孵育6h可活化切片中星状细胞,该技术可作为良好的体外肝星状细胞激活模型。α-SMA免疫组化是一鉴定体外星状细胞激活的可靠指标。

甘草提取物对2,3,7,8-四氯二苯并-p-二噁英致建鲤精密肝切片组织损伤中生化指标及免疫功能的影响

利用精密肝组织切片来评价甘草提取物对2,3,7,8-四氯二苯并-p-二噁英(TCDD)诱导建鲤精密肝切片损伤的保护作用,将制备的肝组织切片分为6个处理组,即Control组、TCDD模型组、甘草提取物对照组、甘草提取物前处理组、甘草提取物后处理组、甘草提取物前后处理组,其中甘草提取物前处理组、甘草提取物后处理组、甘草提取物前后处理组分别换用含0.2、0.4、0.8 mg·m L-1的甘草提取物L-15培养基与精密肝切片共培养,用于检测损伤肝切片培养液中丙氨酸转氨酶(GPT)、天冬氨酸转氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、免疫球蛋白M(Ig M)的含量变化,结果表明:前处理组甘草提取物可以较好缓解TCDD对肝组织造成的损伤,降低了肝切片培养液中GOT、GPT活性以及MDA、TNF-α、IL-1β、Ig M含量,提高了培养液中SOD活性。这说明甘草提取物可以有效抑制TCDD造成的肝组织损伤,对肝组织具有明显的保护作用。

基于精密肝切片技术的野百合碱体外肝毒性初步研究

目的:对精密肝切片技术进行实验条件的优化,并依此技术对野百合碱的体外肝毒性进行初步的研究探讨。方法:利用震荡切片机制备肝切片,通过对培养液、切片厚度、pH及不同培养温度等条件下,肝切片MTT还原能力的测定,建立肝切片培养技术,并将肝切片与野百合碱共培养,连续监测法测定GPT,GOT,LDH,GGT酶活浓度,BCA法测定蛋白含量,观察其对肝切片MTT还原能力及以上生化指标的影响。结果:精密肝切片厚度在200μm,pH 6.8,37℃,BPM培养液中肝切片MTT还原能力最强;野百合碱0.02,0.1,0.5 g.L-1与肝切片共培养24 h,LDH漏出率显著上升,蛋白含量显著下降;野百合碱3个剂量组与肝切片共培养6 h,对MTT还原能力及生化各项指标无明显影响。结论:大鼠精密肝切片在BPM培养基的优化培养条件下,MTT还原能力可维持24 h;野百合碱0.02,0.1,0.5 g.L-1与肝切片共培养24 h,显示出一定的肝脏毒性。

大鼠肝纤维化精密切片技术的建立

目的 :建立肝纤维化精密切片技术 ,摸索最佳体外培养条件 ,用于体外肝脏异物代谢和药物相互作用研究。方法 :建立大鼠复合因素 (高脂、酒精和CCl4)肝纤维化模型 ,制备肝纤维化状态下的肝切片 ,建立培养系统 ,以培养基中乳酸脱氢酶 (LDH)漏出量、肝组织中谷胱甘肽S 转移酶 (GST)活性、肝细胞噻唑蓝 (MTT)还原能力为指标 ,观察切片厚度、培养液pH值和培养时间对肝切片活力的影响。结果 :大鼠经复合因素处理后 ,3周即可造成肝纤维化早期病理改变。在切片厚度 30 0 μm、培养液pH 7.0的条件下 ,肝切片在 6h内能够维持最低的LDH漏出量和最高的GST活性、MTT还原量。结论 :肝纤维化状态下的精密肝切片技术 ,其切片厚度30 0 μm、培养液pH 7.0、培养时间 6h时为最佳培养条件。

精密肝切片技术在肝纤维化研究中的应用研究进展

精密肝切片（precision-cutliverslice，PCIS）技术是一种介于器官与细胞水平间的肝脏体外实验技术，由于其切片技术相对简单，无需使用胶原酶，且能够较完整保存正常组织结构、细胞联系及细胞极性（polarityofhepaticcell），因而能最大限度地模拟在体状态，目前已广泛应用于药物（或毒物）代谢、氧化应激、种属间药物作用差异等方面的研究.近年来，PCLS技术因其在研究肝星状细胞（HSC）激活和肝纤维化方面的潜在应用价值而受到愈来愈广泛地关注。

阿魏酸钠对乙醇损伤性大鼠肝切片的保护作用及机制

目的:采用精密肝切片技术,研究阿魏酸钠(SF)对乙醇损伤性大鼠肝切片的保护作用及机制。方法:制作大鼠乙醇损伤肝切片模型,观察不同浓度SF对切片培养液中肝损伤标志酶及胞浆苯胺羟化酶(ANH)、乙醇脱氢酶(ADH)活性的影响。结果:乙醇50mmol·L-1作用肝切片4h时,培养液中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和谷胱甘肽S-转移酶活性明显升高,同时肝切片胞浆ANH活性升高、ADH活性降低。当共处理SF463~1388nmol·L-14h后,培养液中各酶活性显著降低至正常水平,SF浓度增至694nmol·L-1以上时,肝切片胞浆ANH和ADH活性也恢复正常。结论:SF能有效拮抗乙醇所致的肝损伤,其机制与改变乙醇代谢途径有关。

吲哚-3-原醇对乙醇损伤性大鼠肝切片的保护作用

目的 采用精密肝切片技术 ,研究十字花科类蔬菜提取物吲哚 3 原醇 (I3C)对乙醇肝损伤的作用及机制。方法 制作大鼠乙醇损伤肝切片模型 ,观察不同剂量I3C对培养液中肝损伤标志酶及肝细胞浆苯胺羟化酶 (ANH)、乙醇脱氢酶 (ADH)活性的影响 ,并进行组织学检查。结果 乙醇5 0mmol·L-1作用肝切片 4h时 ,培养液谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和谷胱甘肽S 转移酶活性明显升高 ,同时肝细胞浆ANH活性升高、ADH活性降低 ;加入 10 0～ 4 0 0μmol·L-1的I3C后 ,培养液中各酶活性降低的同时 ,肝细胞ANH和ADH活性恢复正常。肝切片病理学检查也证实I3C的保护作用。结论 I3C能有效拮抗乙醇所致的肝损伤 ,其机制与改变乙醇代谢途径有关。

中药肝毒性及肝脏保护作用的研究方法进展

近年来,中药的肝毒性越来越被人们所了解和重视,中药的肝毒性及肝脏保护作用的研究方法已被广泛建立。与传统的动物体内药代动力学实验相比,精密肝切片法、肝细胞及亚细胞模型体外实验法得以直观地反映出药物对细胞及组织的影响。基因组学,蛋白质组学,代谢组学的方法利用质谱联用技术找出新的生物标记物,阐明肝毒性机制。这一系列的进展为广大的药学工作者对中药肝毒性及肝脏保护作用的研究提供了较大的帮助。

2,3,7,8-四氯二苯并-p-二恶英对建鲤肝组织损伤作用研究

利用精密肝切片培养技术研究2,3,7,8-四氯二苯并-p-二恶英(TCDD)对建鲤肝组织的损伤作用,将精密肝切片组织分为5个处理组,每个处理组4个重复,将不同浓度TCDD(浓度设定为0.00、0.05、0.10、0.30、0.60μg/L)处理肝切片3 h后,收集上清培养液及肝切片组织测定丙氨酸转氨酶(GPT)、天冬氨酸转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、三磷酸腺苷(ATP)等生化指标含量变化。结果表明:TCDD浓度在0.30μg/L时,对精密肝切片组织损伤较大,可以显著提高上清培养液中GPT、GOT、MDA的含量,显著提高切片匀浆上清液中LDH的活性值,与空白对照组相比,差异极显著(P<0.01);可以显著降低切片匀浆上清液中ATP、GSH-PX的含量,与空白对照组相比,差异极显著(P<0.01);显著降低上清培养液中SOD活性值,与空白对照组相比,差异显著(P<0.05)。这说明采用TCDD进行急性染毒后,可以造成建鲤肝组织的损伤,使机体组织处于氧化应激状态,产生一系列氧化应激反应。

基于雷公藤和雷公藤多苷片提取物肝毒性检测的微流控肝器官芯片技术研究

目的 使用一种在微米尺度空间对流体进行操控,以模拟体内微环境为主要特征的微流控肝器官芯片技术,评价雷公藤提取物(Tripterygium wilfordii extract,TWE)和雷公藤多苷片提取物(Tripterygium Glycosides Tablet extract,TGE)的肝脏毒性,比较微流控-精密肝切片、静态-精密肝切片、微流控-HepaRG细胞培养体系的差异性。方法 将新鲜的大鼠肝脏进行精密切片处理后,分别置于静态/微流控培养体系中进行培养,微流控-HepaRG细胞培养体系则是将HepaRG细胞接种到已预先接种人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的培养小室中加药培养;TWE终质量浓度为0.30、0.60、1.20 mg/mL(以生药量计),TGE终质量浓度为31.25、62.50、125.00μg/mL,共孵育24 h后进行肝脏损伤标志物的测定及形态学观察。结果 在不额外添加药物的正常培养情况下,微流控/静态精密肝切片培养上清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、总胆汁酸(total biliary acid,TBA)的表达均明显高于微流控-HepaRG细胞培养体系。与TWE和TGE共培养后,微流控-精密肝切片培养体系中,高剂量的TWE和TGE均可导致培养上清中ALT、LDH和谷氨酰转移酶(gamma glutamyl transferase,GGT)活性的显著升高,TWE还可以显著升高总胆红素(total bilirubin,TBil)的含量,并显示出一定的量-毒关系;而在静态-精密肝切片培养体系中,仅中剂量的TGE可导致ALT和LDH活性的显著升高,且未见剂量相关性;在微流控-HepaRG细胞培养体系中,仅GGT的含量显著升高。组织病理学检查结果显示,TWE和TGE低、中、高剂量对共培养体系中的HUVECs形态均未见明显影响,说明受试药不影响共培养体系的血管仿生结构;TWE和TGE在微流控培养体系或静态培养体系下,低、中、高剂量均会对精密肝切片造成不同程度的损伤,肝细胞出现不同程度肿胀,弥漫性肝细胞核溶解、消失,肝细胞索结构松散,但仅在微流控-精密肝切片培养体系下,形态学的改变呈现出一定的剂量相关性;在微流控-HepaRG细胞培养体系中,仅高剂量的TWE和TGE可导致细胞形态的明显改变。结论 在微流控-精密肝切片培养体系下,TWE和TGE所造成的肝损伤特点一致,具有明显的量-毒关系,表明微流控肝器官芯片技术可以更灵敏、更准确地反映出受试物对肝脏的损伤情况,且有可能成为临床前中药肝毒性评价的新的技术手段。

科技动态

新发明：固定鱼类新鲜肝组织 近日,由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心中匈鱼类免疫药理学国际联合实验室发明的＂基于精密肝切片技术的鱼类新鲜肝组织的固定方法＂,获得国家发明专利授权。该发明的主要内容包括：配置浓度为10～50克/升的琼脂糖溶液,将所述琼脂糖溶液放置于容器中,待温度降至10～60℃时,将采集的鱼类新鲜肝组织放置其中,然后等琼脂糖溶液完全凝固,即实现了对鱼类新鲜肝组织的固定。

何首乌肝毒性物质基础探索研究

通过观察何首乌中蒽醌类成分对Hep G2细胞的细胞毒作用,并通过精密肝切片技术对细胞毒成分进行验证,探讨何首乌致肝毒性的物质基础。运用MTT法检测何首乌中游离蒽醌、结合蒽醌及柰类共11个单体成分对Hep G2细胞的毒性。将有明确细胞毒的成分与大鼠肝切片共同培养6 h后制备肝组织匀浆,通过BCA法测定匀浆液中蛋白含量,连续监测法测定并计算每1μg蛋白中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰氨基转肽酶（GGT）和乳酸脱氢酶（LDH）的漏出率,以考察这些成分对肝组织的毒性作用。细胞试验结果显示,只有大黄酸、大黄素、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素甲醚-8-O-（6＇-O-乙酰基）-β-D-葡萄糖苷显示一定的细胞毒作用,其IC50分别为71.07,125.62,242.27,402.32μmol·L-1,而其他7个化合物的毒性很小。肝切片试验结果显示,大黄酸400μmol·L-1组能引起肝切片ALT,AST,LDH漏出率的显著升高（P〈0.01）,100μmol·L-1组能引起肝切片LDH漏出率的显著升高（P〈0.05）;随药物浓度增大,肝切片中蛋白含量显著下降（P〈0.05）,显示有一定的量毒关系。大黄素400μmol·L-1组可引起肝切片ALT,GGT,LDH漏出率的显著升高（P〈0.01）。大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷800μmol·L-1组能引起肝切片ALT,AST,LDH漏出率的显著升高（P〈0.01或P〈0.05）,200μmol·L-1组能引起肝切片LDH漏出率的显著升高（P〈0.05）;且随药物浓度的增大肝切片中ALT,AST,LDH漏出率呈升高趋势,蛋白含量呈下降趋势。此外,浓度为800μmol·L-1的大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷还可使肝切片MTT还原能力显著下降（P〈0.01）。结果提示,大黄酸、大黄素及大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷只有在高浓度（≥400μmol·L-1）时才可能对肝组织产生一定的损害作用。但是,据文献报道这3个成分的体内暴露水平都很低,要达到毒性浓度（400μmol·L-1或800μmol·L-1）的暴露水平,转化为健康成人至少分别需要单次口服4 898,339,5 581 g的何首乌药材,这与何首乌的临床使用剂量（生首乌3~6 g,制首乌6~12 g）相差甚远,因此,＂蒽醌类成分是何首乌肝毒性成分＂这一说法是缺乏科学依据的。

款冬花及其总生物碱的肝脏毒性

目的:对款冬花的肝脏毒性进行初步的研究探讨。方法:昆明种小鼠ig款冬花水煎液生药20,40 g.kg-1连续4周,测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,肝组织称重,计算肝脏系数,观察肝脏病变情况并评分;利用精密肝切片培养技术,将款冬花水煎液0.005,0.05 g.L-1和总生物碱0.5,2.0 g.L-1与肝切片分别共同培养24,6 h后,制备肝组织匀浆,BCA法测定匀浆液中蛋白含量,连续监测法测定并计算每微克蛋白中ALT,AST,乳酸脱氢酶(LDH),γ-谷氨酰胺转移酶(GGT)的漏出率。结果:款冬花水煎液40 g.kg-1ig 4周后,镜下观察雌性动物款冬花水煎液组与对照组比较有明显病理改变,且伴有肝脏系数的明显增加;款冬花水煎液及总生物碱与肝切片共培养后,水煎液2个剂量组均能引起ALT漏出率的显著升高;总生物碱0.5 g.L-1组能引起肝切片LDH,ALT漏出率显著升高,2.0 g.L-1组能引起肝切片GGT漏出率显著升高,蛋白含量显著下降。结论:款冬花体内体外试验均显示出一定的肝脏毒性。