精密肝切片技术在药物研究中的应用

精密肝切片是近年来迅速得到广泛应用的一种体外研究方法。该技术是介于器官与细胞水平之间的体外培养技术,可包含肝组织内的所有类型的细胞,保存完好的组织结构。在一定的程度上模拟了体内的肝环境,有利于观察细胞基质和细胞间的相互作用和外源性物质的代谢情况,可同时观察代谢酶的区域性分布和肝脏中各类型细胞的相互作用。此外在毒理学方面可以通过检查培养基中酶含有量的变化,结合肝切片的病理变化和免疫组化等技术,研究肝毒性的特点和机制。本文对精密肝切片的特点及其在药物代谢、毒理学应用等方面进行综述,以供药物研究参考。

精密肝切片技术在肝纤维化研究中的应用研究进展

精密肝切片（precision-cutliverslice，PCIS）技术是一种介于器官与细胞水平间的肝脏体外实验技术，由于其切片技术相对简单，无需使用胶原酶，且能够较完整保存正常组织结构、细胞联系及细胞极性（polarityofhepaticcell），因而能最大限度地模拟在体状态，目前已广泛应用于药物（或毒物）代谢、氧化应激、种属间药物作用差异等方面的研究.近年来，PCLS技术因其在研究肝星状细胞（HSC）激活和肝纤维化方面的潜在应用价值而受到愈来愈广泛地关注。

醋氨酚所致精密肝切片损伤模型的建立及CYP2E1的调节作用

目的:利用精密肝切片(PCLS)技术,建立醋氨酚所致肝切片损伤的体外模型,并探讨CYP2E1活性变化对肝损伤的调节作用,为研究和筛选肝保护药物提供实验依据。方法:利用振荡切片机制备PCLS,建立培养系统。将终浓度为500μmol/L的醋氨酚分别与切片共孵育0、2、4、6h,测定培养基和切片中的谷胱甘肽S-转移酶(GST)和乳酸脱氢酶(LDH)活性。在体给予不同剂量(0.25、0.5、1.0g/kg)的CYP2E1诱导剂乙醇,每天一次,连续3d。末次给药8h后处死动物,取其肝脏制备PCLS,再与500μmol/L醋氨酚共同孵育6h,检测ALT和LDH漏出率。正常PCLS与不同浓度的二乙基二硫代氨基甲酸酯盐(DDTC,CYP2E1抑制剂)(5、10、20μmol/L)、500μmol/L醋氨酚共同孵育6h,检测ALT和LDH漏出率。结果:与常规培养组比较,醋氨酚孵育4、6h组的GST和LDH漏出率显著升高(P<0.01)。与醋氨酚模型对照组比较,乙醇中、大剂量组LDH漏出率和小、大剂量组ALT漏出率皆升高(P<0.01,P<0.05);DDTC各浓度组ALT漏出率则降低(P<0.05)。结论:PCLS与500μmol/L醋氨酚共孵育4h即能成功地建立体外肝切片损伤的模型。抑制CYP2E1活性可能对醋氨酚所致的肝损伤有保护作用,而上调CYP2E1活性则可能加重醋氨酚所致的肝损伤。

吲哚-3-原醇对乙醛所致精密肝切片中星状细胞活化的影响

目的利用精密肝切片(PCLS)技术,研究吲哚-3-原醇(I3C)对乙醛活化肝星状细胞(HSCs)的作用及其机制。方法将200～800μmol.L-1的I3C及700μmol.L-1乙醛与PCLS共同孵育6h,免疫组化法分析肝切片中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,并检测培养液中谷胱甘肽S-转移酶(GST)和乳酸脱氢酶(LDH)活性、转化生长因子-β1(TGF-β1)含量、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)及基质金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)表达量及组织丙二醛(MDA)和羟脯氨酸(Hyp)含量。结果200～800μmol.L-1I3C可不同程度的减少乙醛激活的HSCs,并可明显降低乙醛升高的培养液中GST、LDH活性和肝组织中MDA和Hyp含量(P<0.05或P<0.01),呈良好的浓度依赖性。I3C给药组与乙醛对照组比较,培养液中TGF-β1含量降低(P<0.01),MMP-1/TIMP-1蛋白表达比值升高(P<0.01)。结论I3C能有效拮抗乙醛所致的HSCs活化,其机制与降低细胞氧化应激和促进基质胶原降解有关。

科技动态

新发明：固定鱼类新鲜肝组织 近日,由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心中匈鱼类免疫药理学国际联合实验室发明的＂基于精密肝切片技术的鱼类新鲜肝组织的固定方法＂,获得国家发明专利授权。该发明的主要内容包括：配置浓度为10～50克/升的琼脂糖溶液,将所述琼脂糖溶液放置于容器中,待温度降至10～60℃时,将采集的鱼类新鲜肝组织放置其中,然后等琼脂糖溶液完全凝固,即实现了对鱼类新鲜肝组织的固定。

何首乌肝毒性物质基础探索研究

通过观察何首乌中蒽醌类成分对Hep G2细胞的细胞毒作用,并通过精密肝切片技术对细胞毒成分进行验证,探讨何首乌致肝毒性的物质基础。运用MTT法检测何首乌中游离蒽醌、结合蒽醌及柰类共11个单体成分对Hep G2细胞的毒性。将有明确细胞毒的成分与大鼠肝切片共同培养6 h后制备肝组织匀浆,通过BCA法测定匀浆液中蛋白含量,连续监测法测定并计算每1μg蛋白中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰氨基转肽酶（GGT）和乳酸脱氢酶（LDH）的漏出率,以考察这些成分对肝组织的毒性作用。细胞试验结果显示,只有大黄酸、大黄素、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素甲醚-8-O-（6＇-O-乙酰基）-β-D-葡萄糖苷显示一定的细胞毒作用,其IC50分别为71.07,125.62,242.27,402.32μmol·L-1,而其他7个化合物的毒性很小。肝切片试验结果显示,大黄酸400μmol·L-1组能引起肝切片ALT,AST,LDH漏出率的显著升高（P〈0.01）,100μmol·L-1组能引起肝切片LDH漏出率的显著升高（P〈0.05）;随药物浓度增大,肝切片中蛋白含量显著下降（P〈0.05）,显示有一定的量毒关系。大黄素400μmol·L-1组可引起肝切片ALT,GGT,LDH漏出率的显著升高（P〈0.01）。大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷800μmol·L-1组能引起肝切片ALT,AST,LDH漏出率的显著升高（P〈0.01或P〈0.05）,200μmol·L-1组能引起肝切片LDH漏出率的显著升高（P〈0.05）;且随药物浓度的增大肝切片中ALT,AST,LDH漏出率呈升高趋势,蛋白含量呈下降趋势。此外,浓度为800μmol·L-1的大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷还可使肝切片MTT还原能力显著下降（P〈0.01）。结果提示,大黄酸、大黄素及大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷只有在高浓度（≥400μmol·L-1）时才可能对肝组织产生一定的损害作用。但是,据文献报道这3个成分的体内暴露水平都很低,要达到毒性浓度（400μmol·L-1或800μmol·L-1）的暴露水平,转化为健康成人至少分别需要单次口服4 898,339,5 581 g的何首乌药材,这与何首乌的临床使用剂量（生首乌3~6 g,制首乌6~12 g）相差甚远,因此,＂蒽醌类成分是何首乌肝毒性成分＂这一说法是缺乏科学依据的。