重组结核分枝杆菌精氨酰tRNA合成酶活性验证及晶体生长

目的建立重组结核分枝杆菌ArgRS的制备方法,并验证重组蛋白的生物活性。方法将结核分枝杆菌ArgRS基因插入到pQE60质粒中,通过IPTG诱导表达重组蛋白,使用分子筛制备重组蛋白,并评价重组蛋白分子量。使用圆二色谱评价重组蛋白的折叠情况。通过Thermal Shift Assay进一步验证重组蛋白的生物活性。采用气相扩散法筛选晶体。结果使用pQE60载体获得了重组表达的ArgRS蛋白。凝胶过滤层析纯化重组蛋白并验证了其分子量与天然蛋白一致;Thermal Shift Assay证明重组蛋白的生物活性。使用气相扩散法获得结核分枝杆菌ArgRS分子晶体。结论成功制备出具有天然活性的重组结核分枝杆菌ArgRS蛋白,并获得蛋白质晶体。

氨酰tRNA合成酶非经典作用的研究进展

氨酰tRNA合成酶(ARS)是一类在进化上高度保守且在生物体内广泛表达的必须酶,能将特定的氨基酸连接到同源tRNA,确保遗传信息的正确稳定传递。多种ARS通过蛋白质相互作用形成多tRNA合成酶复合物(MSC)。除了经典的催化合成作用,ARS还参与调控多种生物过程,如细胞凋亡、自噬、细胞衰老、血管生成等。为了更深入了解ARS的功能,该文对ARS的非经典作用进行综述。

精氨酰-tRNA合成酶基因研究进展

精氨酰tRNA合成酶(ArgRS)是蛋白质生物合成过程中具有重要作用的酶,其主要功能是参与tRNA酰基化,属于第一类氨酰tRNA合成酶。作为一种特殊的氨酰tRNA合成酶,精氨酰tRNA合成酶的结构与功能具有重要的探索价值。因此对精氨酰tRNA合成酶基因及表达特性的深入研究,和对其潜在功能的挖掘都是探索蛋白质生物合成机制的关键所在。本文概述了该酶基本的生物学特性,从遗传表达调控和实际应用等方面介绍了精氨酰tRNA合成酶的研究进展,总结了精氨酰tRNA合成酶在临床应用中发挥的作用,以及展望了探索其功能的重要性和今后研究的意义。

大肠杆菌JM83精氨酰－tRNA合成酶基因的克隆、测序及表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）以大肠杆菌ＪＭ８３基因组ＤＮＡ为模板，扩增了精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）基因。将该基因重组到载体ｐＵＣ１８上转化到大肠杆菌ＴＧ１中，得到在转化子中ＡｒｇＲＳ的高表达。粗抽液中ＡｒｇＲＳ的氨酰化活力，ＴＧ１和ＴＧ１转化子分别为１．６５Ｕ／ｍｇ和２１０Ｕ／ｍｇ，后者为前者的１２７倍。ＤＮＡ顺序测定表明，与从大肠杆菌ＪＡ２００中克隆到的ＡｒｇＲＳ基因相比９１３位碱基为Ａ而不为Ｃ，这种变化使ＡｒｇＲＳ的３０５位氨基酸残基由Ｇｌｎ变为Ｌｙｓ，但这种改变不影响酶的活力。

用3′末端氧化的精氨酸tRNA亲和标记大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶

用3′末端氧化的精氨酰tRNA共价修饰大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶,酶的ATP-PPi交换活力和氨酰化活力完全丧失。用SDS-PAGE分析酶与tRNA(?)形成的共价复合物发现:伴随着酶的失活,形成了两种形式明显不同的ArgRS-tRNA(?)复合物,它们对应于凝胶上两条迁移率不同的大分子条带。这一结果与其它合成酶亲和标记的结果不同。ArgRS-tRNA(?)经RNase处理后,ATP-PPi交换活力和氨酰化活力均有部分恢复(小于15％)。在整个标记过程中,酶的两个活力是紧密相关联的。

氨酰tRNA合成酶的分子网络和功能

氨酰tRNA合成酶是生命进化过程中最早出现的一类蛋白质 ,氨酰tRNA合成酶帮助氨基酸转移到相应的tRNA上 ,进而参与蛋白质的合成保证了生命体的严谨性和多样性 .随着后基因组时代的到来 ,氨酰tRNA合成酶的结构和功能成为新的研究热点 .结构生物学和生物信息学的研究结果表明 ,氨酰tRNA合成酶在真核生物体内以多聚复合物的形式行使功能 ,形成复杂的分子网络体系 .最新的实验证据显示 ,氨酰tRNA合成酶不但是蛋白质合成过程中一类最重要的酶 ,而且参与了转录、翻译水平的调控、RNA剪接、信号传导和免疫应答等众多生命活动 .

氨酰-tRNA合成酶对tRNA的识别

氨酰 tRNA合成酶 (aaRS)与tRNA的相互作用保证了蛋白质生物合成的忠实性 .氨酰 tRNA合成酶对tRNA识别的专一性依赖于aaRS特定的催化结构域和tRNA分子特异的三级结构构象 .反密码子和接受茎 (包括 73位 )在大多数aaRS对tRNA分子的识别过程中起着关键作用 ,其他部位如可变口袋、可变 (茎 )环等 。

抗苏氨酰tRNA合成酶抗体阳性的抗合成酶综合征的临床特征

目的探讨抗苏氨酰tRNA合成酶(threonyl-tRNAsynthetase,PL-7)抗体阳性的抗合成酶综合征(antisyn-thetase syndrome,ASS)的临床、血清学和影像学特征。方法收集2010年8月至2011年12月间北京协和医院诊治的5例抗PL-7抗体阳性ASS住院患者的资料,总结其临床表现、实验室检查和影像学特征。结果 5例ASS患者均有肌炎和肺间质病变,发热4例,多关节炎2例,均未见雷诺现象和技工手。胞浆型抗核抗体阳性4例,抗Ro-52抗体阳性3例。肺功能检测提示限制性通气功能和/或弥散功能障碍。胸部高分辨CT显示双下肺网格影和磨玻璃影,伴牵拉性支气管扩张及散在实变影。大剂量糖皮质激素联合环磷酰胺和/或甲氨蝶呤治疗取得较好的临床效果。结论抗PL-7抗体阳性的ASS以肌炎和肺间质病变为突出特征,可伴发热和关节炎,对免疫抑制治疗反应较好。

5例抗丙氨酰tRNA合成酶抗体阳性患者临床特征

目的 探讨抗丙氨酰 tRNA 合成酶（alannyl tRNA synthetase，PL-12）抗体阳性的抗合成酶综合征（anti-synthetase syndrome，ASS）患者的临床特征。方法 分析2010年8月至2013年8月北京协和医院5例抗 PL-12抗体阳性 ASS 住院患者的临床表现、血清学结果和影像学改变。结果 5例抗 PL-12抗体阳性患者的基础疾病为皮肌炎2例，类风湿关节炎/干燥综合征、系统性硬化症和间质性肺炎各1例。5例患者均有肺间质病变，4例为首发和突出表现，胸部高分辨计算机断层扫描显示双下肺网格影和磨玻璃影为主；肺功能提示限制性通气功能和弥散功能障碍。典型皮肌炎皮损和技工手各2例，肌炎、关节炎、雷诺现象和发热各1例。胞浆型抗核抗体阳性4例，抗 Ro-52抗体阳性4例，抗 SSA 抗体阳性1例。5例患者中4例应用大剂量糖皮质激素（0．8～1．5 mg·kg ^-1·d^ -1）联合环磷酰胺（100 mg/d），1例还联用了甲氨蝶呤和环孢菌素 A，1例单独应用雷公藤多甙。治疗后3例患者病情好转，2例患者病情稳定。结论 抗 PL-12抗体与肺间质病变密切相关，而肌炎少见。

人线粒体亮氨酰tRNA合成酶的表达、纯化及其动力学研究(英文)

目的:构建含人线粒体亮氨酰tRNA合成酶(mtLeuRS)基因的重组表达载体,表达纯化mtLeuRS并检测其酶促动力学参数。方法:克隆mtLeuRS基因,构建入pET-24a(+)表达载体,转化大肠杆菌BL21-codonPlus(DE3)-RIL,经诱导产生带6-His标签的mtLeuRS融合蛋白,再经Ni2+亲和层析柱一步法纯化后用酶促反应检测其氨酰化活力。作为mtLeuRS酶促反应底物,人tRNALeu(UUR)由T7 RNA聚合酶体外转录生成。结果:经IPTG诱导,人mtLeuRS蛋白表达量约占细菌总蛋白量的1％～2％,1 L培养液的菌体内可收获约2 mg的纯化酶蛋白。通过体外转录生成的酶底物tRNALeu(UUR)可达转录模板的100倍。经酶促反应,人mtLeuRS可氨酰化人线粒体内tRNALeu(UUR)。反应的亲和常数(Km)为16.67μmol/L,催化常数(Kcat)为0.17s-1。结论:本实验成功克隆并表达了人mtLeuRS,并成功用于催化tRNALeu(UUR)的氨酰化。

结核分枝杆菌甲硫氨酰tRNA合成酶与底物及其类似物的结合比较

目的建立重组结核分枝杆菌甲硫氨酰tRNA合成酶(MetRS)的制备方法,分析底物及其类似物与重组蛋白的结合能力。方法将结核分枝杆菌MetRS(MtMetRS)基因置于不同启动子调控之下。通过表达筛选选择重组蛋白大量制备的条件,使用分子筛制备重组蛋白,并验证其分子量。使用Thermal Shift Assay比较MetRS底物及其类似物与重组结核分枝杆菌MetRS的结合能力。结果通过不同重组质粒的表达筛选,确定重组蛋白制备方法。Thermal Shift Assay分析提示甲硫基腺苷酸(methionyl-adenylate,MetAde)与焦磷酸同时存在时可以提高重组蛋白的热稳定性。结论成功制备出具有天然活性的重组MtMetRS蛋白;应以甲硫基腺苷酸和焦磷酸分子结构为方向,设计、筛选结核分枝杆菌MetRS抑制剂。

人类组氨酰TRNA合成酶类似物的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:在原核系统中表达并纯化人类组氨酰TRNA合成酶类似物蛋白,制备多克隆抗体。方法:设计引物扩增其开放阅读框,重组入原核表达载体PQE30,并在大肠杆菌M15中诱导表达;应用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔。结果:①成功构建人类组氨酰TRNA合成酶类似物的原核表达载体;②经NI亲和层析获得纯度较高的重组蛋白;③制备了高滴度的兔抗人类组氨酰TRNA合成酶类似物蛋白的多克隆抗体。结论:原核表达载体的构建、重组蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备为今后研究该蛋白的功能提供了良好的基础。

氨酰—tRNA合成酶的结构和功能研究

基于顺序分析及晶体结构研究,按照氨酰—tRNA合成酶的特征顺序和结构模体(motif)可将其分为两个主要的类别,对应着催化及底物结合域。

结核分枝杆菌甲硫氨酰tRNA合成酶的结晶方法

目的 制备结核分枝杆菌甲硫氨酰tRNA合成酶(Mt MetRS)晶体。方法 设计不同的重组Mt MetRS蛋白,使用大肠杆菌表达重组蛋白。坐滴气相扩散法在293 K温度下筛选不同重组蛋白的结晶条件,并使用悬滴法进行晶体优化。优化的晶体经液氮速冻保存。在上海同步辐射光源进行晶体衍射数据采集。结果 使用不同设计的重组蛋白进行结晶筛选和优化,最终获得了可以进行晶体衍射的高分辨率蛋白质晶体。并确定6×His序列在Mt MetRS分子的结晶中起到关键作用。结论 Mt MetRS分子两端的6×His序列是帮助Mt MetRS分子结晶的重要因素。

甘氨酰tRNA合成酶对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响

甘氨酰tRNA合成酶(glycyl-tRNA synthetase,GlyRS)是重要的氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetases,aaRSs)家族成员。目前,国内外关于GlyRS在奶牛乳腺发育过程中表达及调节的研究鲜有报道。为了揭示GlyRS的表达与奶牛乳腺发育与泌乳之间的关系,本试验应用EdU免疫荧光法、流式细胞术检测GlyRS对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)中DNA数目及细胞周期的影响,实时荧光定量PCR、Western blotting技术检测GlyRS对BMEC中Cyclin D1的表达影响。结果显示,GlyRS过表达时,细胞的DNA合成、处于S期和G2/M期的细胞数、细胞中Cyclin D1的表达均增加;GlyRS抑制后,细胞的DNA合成、处于S期和G2/M期的细胞数、细胞中Cyclin D1的表达均减少。表明GlyRS通过上调Cyclin D1的表达,加快细胞周期转换,增加DNA合成数目,从而促进BMEC增殖。

氨酰tRNA合成酶作用机制及其应用

氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetases,aaRSs)通过催化氨基酸与相应tRNA的氨酰化以保证遗传信息翻译的准确性,在生物体内具有重要作用。近年来,随着对aaRS催化机制理解的不断加深,aaRS的应用逐渐成为研究热点。在细菌中,aaRS活性被抑制后会导致其生命活动发生紊乱,根据aaRS在人体与病原菌内不同的催化特点设计针对病原体的特异性aaRS抑制剂,将有助于开发以aaRS为靶标的新型抗生素。另外,通过突变aaRS可以在蛋白质序列中定点掺入非天然氨基酸,扩展蛋白质工程。本文简述了aaRS的分类、结构与功能的特点,并在此基础上综述了aaRS在研发新型抑制剂,设计改造特殊蛋白质等方面的应用。

甘氨酰tRNA合成酶在小鼠围着床期子宫及蜕膜化过程的时空特异性表达

核编码的甘氨酰-tRNA合成酶(Glycyl-tRNA Synthetase, GlyRS)是细胞质和线粒体蛋白质翻译所必需的,GlyRS除了在蛋白翻译中的作用外,它还参与基因转录、炎症和细胞增殖等其他生物学过程。本研究从mRNA水平和蛋白水平检测了GlyRS在小鼠早期妊娠1~8 d模型、人工诱导蜕膜化模型和体外诱导人子宫内膜基质细胞蜕膜化模型中的表达规律。结果表明:GlyRS mRNA和蛋白在小鼠早期妊娠1~4 d的腔上皮和腺上皮中表达,在小鼠早期妊娠5~8 d主要在胚胎和蜕膜区表达;随着蜕膜化程度增加,表达量逐渐增加;在人工诱导蜕膜化模型中,诱导组GlyRS mRNA和蛋白表达情况类似,表达量均明显高于对照组。在体外诱导的人子宫内膜基质细胞蜕膜化模型中,诱导组GlyRS mRNA表达量随着诱导天数的增加而增加,均显著高于对照组。以上结果表明GlyRS参与小鼠早期妊娠及子宫蜕膜化的过程。

钝齿棒杆菌异源表达乙酰辅酶A合成酶对L-精氨酸合成的影响

L-精氨酸是一种人体必需氨基酸,在医疗保健、食品添加等制造行业中商业价值显著。针对1株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5进行代谢改造,通过比较异源乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthetases,ACS)的酶学性质,构建了过表达ACS的重组钝齿棒杆菌SYPA-ACS,能有效利用乙酸提高菌株产L-精氨酸能力。首先在大肠杆菌中分别克隆表达及纯化4种不同细菌来源的ACS,发现巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)ATCC 33445来源的ApACS1酶活力最高,为784.59 U/mL,最适反应的pH为7.0,最适反应温度37℃,与其他3种ACS来源相比,ApACS1具有更好的pH和温度稳定性。然后通过pXMJ19载体,将A.pasteurianus来源的编码基因acs_(1)在C.crenatum中表达,有效提高了乙酰辅酶A含量。利用5 L发酵罐,将SYPA-ACS菌株培养96 h后,L-精氨酸的产量达53.43 g/L,产率为0.577 g/(L·h),相较于出发菌株SYPA5-5,产量提高了27.48%。该策略既可以利用乙酸,降低乙酸对菌株的危害作用,又能提高乙酰辅酶A的含量,促进L-精氨酸的积累。研究结果为L-精氨酸的制备提供了绿色、高效的合成策略,具有工业化应用潜力。

氨基酰-tRNA合成酶及其与相关tRNA的相互作用研究

氨基酰tRNA合成酶是生物体蛋白质合成过程中的一类关键酶 ,对它的研究具有重要的生物学意义和应用前景。该项目系统研究了大肠杆菌亮氨酰 和精氨酰 tRNA合成酶及其与相关tR NA的相互作用。用酶和tRNA的基因克隆和高表达 ,tRNA体外转录 ,基因定点突变 ,酶片段的体外重组等手段研究了酶与tRNA的相互作用的结构基础 ,得到一系列重要结果。

氨酰tRNA合成酶研究进展

氨酰t RNA合成酶作为生命进化中出现的最早的蛋白质之一,可促进氨基酸转移到t RNA上,参与生物体蛋白质合成。伴随生物技术革命的到来,氨酰t RNA合成酶内部结构以及生物功能成为国内外学者的研究热点。在真核生物体内,氨酰t RNA合成酶以聚复合物形式表达功能,连接复杂的生物分子体系。氨酰t RNA合成酶作为蛋白质合成中最重要的一类酶,还直接参与、调控、RNA转录、蛋白质翻译、信号传导、RNA剪接以及免疫应答等许多生物的生命体征运动。学者进一步还证实氨酰t RNA合成酶可以作为一种抗肿瘤药物潜在靶点。