东湖假单胞菌HYS中的精氨酸琥珀酰转移酶途径缺失对秀丽隐杆线虫毒性的影响

【背景】东湖假单胞菌HYS是本实验室从武汉东湖水域中分离并鉴定的一株高产铁载体细菌,HYS菌株对秀丽隐杆线虫具有较强毒性。前期研究发现HYS中编码精氨酸琥珀酰转移酶基因(argS)的插入突变可导致其对线虫毒性明显减弱。【目的】探究argS基因功能及其如何参与细菌毒性,为后续深入研究HYS菌株的毒性机制提供理论依据。【方法】采用生物信息学比对、遗传分析和生理生化实验确认argS基因的生物学功能及其参与的精氨酸琥珀酰转移酶(arginine succinyltransferase,AST)途径与细菌毒性的关系。【结果】生物信息学比对结果显示argS编码精氨酸琥珀酰转移酶,其蛋白序列与铜绿假单胞菌中精氨酸琥珀酰转移酶β亚基具有高达88%的相似度;缺失argS导致菌株不能利用精氨酸作为唯一碳源进行生长;精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase,ADC)、精氨酸脱氢酶(argininedehydrogenase,ADH)以及精氨酸脱亚胺酶(argininedeiminase,ADI)途径中关键基因缺失菌株均可正常利用精氨酸作为唯一碳源,且对线虫并无明显毒性减弱现象;添加外源精氨酸导致菌株对线虫的减毒效果更加明显,且菌株产铁载体能力显著下降。【结论】东湖假单胞菌HYS中AST途径可以通过影响菌株铁载体合成来影响其对秀丽隐杆线虫的毒性,本研究为深入了解假单胞菌精氨酸代谢和致病性机制提供了新依据。

精氨酸脱羧酶和谷酰胺转移酶活性的测定方法

介绍了一种测定精氨酸脱羧酶和谷酰胺转移酶活性的方法———苯甲酰化 紫外检测 ,并鉴定了该方法的灵敏性。

不对称二甲基精氨酸上调THP-1来源的巨噬细胞和泡沫细胞内胆固醇酰基转移酶-1的表达(英文)

目的观察不对称二甲基精氨酸(ADMA)对单核细胞THP-1来源的巨噬细胞和泡沫细胞中胆固醇酰基转移酶-1(ACAT-1)的表达及胆固醇含量的影响。方法分别采用RT-PCR和Western blot技术检测ACAT-1mRNA和蛋白表达水平。采用酶偶联比色法检测细胞内胆固醇含量。结果不同浓度的ADMA(0,3.75,7.5,15,or30μmol/L)对THP-1来源的巨噬细胞和泡沫细胞作用不同时间(6、12、24h)后,巨噬细胞和泡沫细胞内ACAT-1mRNA和蛋白的表达明显上调,细胞内总胆固醇的含量明显升高。结论 ADMA在巨噬细胞形成泡沫细胞过程中可能发挥了重要作用。抑制巨噬细胞和泡沫细胞内ACAT-1可能成为治疗动脉粥样硬化的潜在靶点。

琥珀酰辅酶A转移酶硝基化酪氨酸位点特异单克隆抗体的制备

线粒体琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)含有4个酪氨酸残基,其4、76位点酪氨酸(Tyr4、Tyr76)的硝基化可导致其酶活性下降,制备特定的抗体可对其硝基化水平和位点进行检测。应用淋巴细胞杂交瘤技术,以化学合成的含琥珀酰辅酶A转移酶硝基化Tyr4和Tyr76肽段为半抗原,偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)后,作为免疫原免疫Balb/c小鼠,分离免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了多株融合细胞。经对融合细胞多次筛选和检测,最终获得4株单克隆抗体,分别对应SCOT Tyr4和Tyr76硝基化后表位,其间接ELISA检测效价分别达到1∶128 000、1∶32 000、1∶512 000和1∶4 096 000,表明抗体具有较强特异性和灵敏度。

慢性肝病患者血清精氨[基]琥珀酸裂合酶的变化

目的建立自动生化分析仪检测血清精氨[基]琥珀酸裂合酶(ASL)的方法,探讨其对慢性肝病的诊断效能。方法测定149例慢性肝病患者、247例非肝病患者和32例健康对照血清ASL活性,同时测定ALT和AST活性。结果本组病例ASL、ALT和AST水平与健康对照间均存在明显差异;对照组与非肝病患者ASL活性无明显差异(q=0.051,P=0.959);慢性肝病组与非肝病组、健康对照组ASL活性无重叠。ROC曲线显示ASL对判断慢性肝病的敏感性为98.7%,特异性为97.5%(cutoff值=9.2U/L);ALT、AST的敏感性为60.4%和57.7%,特异性仅分别为33.4%和36.6%(cutoff值=40.0U/L)。结论ASL诊断慢性肝病的敏感性和特异性均优于AST和ALT,是慢性肝病诊断的有用指标。

肽酰精氨酸的翻译后修饰

肽酰精氨酸残基甲基化作用是细胞质与细胞核内蛋白质翻译后修饰的普遍方式。精氨酸残基甲基化蛋白质与许多细胞生物学过程有关,包括转录调节、RNA代谢和DNA损伤修复等。生物体内精氨酸N-甲基转移酶类、肽酰精氨酸脱亚氨酶类与JMJD6等催化肽酰精氨酸残基进行甲基化、瓜氨酸化和去甲基化的动态修饰。这种动态修饰对细胞生物学功能有重要调节作用。

原核细胞精氨酸生物合成途径的研究进展

原核生物的精氨酸生物合成包含8个酶系,起始于乙酰谷氨酸激酶催化的谷氨酸的乙酰化。到第五步乙酰基团脱离,乙酰谷氨酸通过3个酶的作用,进一步合成乙酰化中间产物。鸟氨酸被氨甲酰基化生成瓜氨酸,天冬氨酸介入后形成精氨琥珀酸,最后形成终产物精氨酸。主要就精氨酸生物合成途径、合成过程中主要酶系及反馈抑制蛋白的作用机制进行了概述。此外,提出了目前精氨酸代谢研究中存在的问题及未来的研究方向。

L-精氨酸增强人凝血因子Ⅷ基因表达机制的研究

目的:进一步探讨L-精氨酸能够增强人凝血因子Ⅷ(hFⅧ)基因在体外的表达机制。方法:扩增B结构域缺失的hFⅧcDNA(BDDhFⅧcDNA)的A1、A2、A3、C1和C2结构域基因,并将其作为启动子,分别插入含氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的载体pCAT3-Enhancer的启动子位点,构建成载体pA1-CAT3-Enhancer、pA2-CAT3-Enhancer、pA3-CAT3-Enhancer、pC1-CAT3-Enhancer和pC2-CAT3-Enhancer。再将各载体分别转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后,加入L-精氨酸(终浓度10mmol/L)培养24h。实验设转染阴性对照(不含启动子)、转染阳性对照,各组再设加L-精氨酸及不加L-精氨酸的对照组(共14组)。采用体外细胞核连缀反应(run-onassay)检测CAT基因的转录,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组HUVECs裂解液中CAT蛋白的含量。结果:在无L-精氨酸存在的情况下,转染阴性对照载体pCAT3-Basic、pA3-CAT3-Enhancer、pC1-CAT3-Enhancer和pC2-CAT3-Enhancer的HUVECs裂解液中均未检测到有CAT基因转录,CAT蛋白含量均为背景值,转染阳性对照载体pCAT3-Control的HUVECs裂解液中CAT基因有强转录,转染pA1-CAT3-Enhancer和pA2-CAT3-Enhancer的HUVECs裂解液中只能检测到微弱的CAT基因转录,CAT蛋白含量分别为(61.85±7.86)pg/106个细胞和(60.27±7.27)pg/106个细胞。在与L-精氨酸共培养24h后,转染pA2-CAT3-Enhancer的HUVECs裂解液中CAT基因的转录和蛋白表达显著增强,CAT蛋白含量达到(368.56±21.85)pg/106个细胞,显著高于未加L-精氨酸组(P<0.01),而转染其他各载体的HUVECs裂解液中CAT基因转录和表达的变化与未加L-精氨酸组间差异均无统计学意义。结论:hFⅧ的A1和A2结构域基因能作为启动子驱动CAT基因的转录和表达,而L-精氨酸可显著增强hFⅧA2结构域基因启动的CAT基因转录和表达。

脐血单个核细胞甲基丙二酸单酰CoA变位酶基因和精氨酸琥珀酸合成酶基因基因突变与新生儿遗传性代谢病易感性的关系

目的 探讨脐血单个核细胞甲基丙二酸单酰CoA变位酶基因(MUT)、精氨酸琥珀酸合成酶基因(ASS1)基因突变与新生儿遗传性代谢病易感性的关系。方法 选取2015年5月-2020年6月在宁夏回族自治区妇幼保健院妇产科分娩的16 743例新生儿为研究对象,所有研究对象均采集脐带血行单个核细胞MUT、ASS1基因检测,且行遗传性代谢病筛查,根据筛查、确诊结果将所有新生儿分为遗传性代谢病组(疾病组)和无遗传性代谢病组(对照组)。比较两组研究对象MUT、ASS1基因突变情况,并采用logistic回归分析法分析脐血单个核细胞MUT、ASS1基因突变与新生儿遗传性代谢病易感性的关系。结果 16 743例新生儿中共检测出28例伴有MUT基因突变,24例伴有ASS1基因突变;16 743例新生儿最终确诊为45例发生遗传性代谢病,发生率为0.27%,其中有22例伴有MUT基因突变,有17例伴有ASS1基因突变。疾病组分娩周期(早产、过期产及足月产)、出生体质量(低出生体质量、巨大儿及正常体质量)占比与对照组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05),疾病组MUT基因突变、ASS1基因突变及有家族史占比均明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。多因素logistic回归分析结果显示,MUT基因突变、ASS1基因突变及家族史均是新生儿遗传性代谢病易感性的风险因素(Wald χ^(2)=26.460、21.221及14.632,OR=3.889、3.501及2.986,均P<0.05)。结论 脐血单个核细胞MUT基因突变和ASS1基因突变均可增加新生儿遗传性代谢病发病风险,临床中可在孕期通过检测MUT、ASS1基因情况而加强产前筛查,以减少缺陷患儿的出生。

血清精氨酸代琥珀酸裂解酶的测定在肝病诊断中的意义

目的探讨血清精氨酸代琥珀酸裂解酶（ASL）对肝病的诊断效能。方法测定291例肝病患者、247例非肝病患者和32名健康对照血清ASL和ALT、AST、GGT、LDH、ALP活性及TBil浓度；其中31例肝病患者进行了病理组织学检查。结果ROC曲线显示ASL对判断肝病的敏感度为100．0％，特异性为91．1％（分界值=8．0U／L）；ALT和AST的敏感度为97．60%和83．8％，特异性仅分别为24．7％和28．3％（分界值=40．0U／L）。ASL在不同肝病的变化情况是肝癌〉急性肝炎〉肝硬化〉慢性肝炎；ASL浓度[（86．9±26．5）u／L]与肝病理组织学炎症活动度计分（9．83±3．36）呈正相关（r=0．417，P=0．019）。结论ASL诊断肝病的敏感度、特异性优于AST和ALT，是肝病诊断的有用指标。

双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD在谷氨酸棒杆菌JNR中的功能

【目的】通过改造谷氨酸棒杆菌JNR中双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD,减弱尿苷酰去除酶的活性,增强NH4+的转运和利用,提高L-精氨酸的合成。【方法】本文对来源于谷氨酸棒杆菌的突变菌株JNR中的双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD进行整合突变,采用同源重组的方法将H414和D415位点突变为两个丙氨酸AA,在此菌株的基础上过量表达PII蛋白GlnK,并对其进行尿苷酰化研究,离子色谱检测摇瓶发酵过程中NH4+的浓度,并对最终的改造菌株进行连续流加发酵分析。【结果】该双功能尿苷酰转移/去除酶在谷氨酸棒杆菌中成功进行整合突变,有效减弱了尿苷酰去除酶的活性;同时过表达PII蛋白GlnK,其酰基化程度明显增强。摇瓶发酵结果表明菌株L4消耗NH4+增加,L-精氨酸产量为36.2±1.2 g/L,比对照菌株L3高出22.7%。5-L发酵罐实验结果显示改造菌株L4的L-精氨酸的产量为52.2 g/L,较野生型菌株L0提高了25.3%。【结论】谷氨酸棒杆菌合成L-精氨酸的过程中氮源是必不可少的。减弱GlnD尿苷酰去除酶的活性后,胞内尿苷酰化的GlnK-UMP增加,GlnK-UMP与氮转录调控因子AmtR结合,转运至胞内的NH4+浓度提高,促使L-精氨酸产量显著提高。

大剂量、短时间补充肌酸停止后大鼠内源性肌酸生物合成恢复的动态观察

目的:探讨大剂量、短时间补充肌酸停止后,大鼠内源性肌酸生物合成的恢复。方法:大鼠补充大剂量(3.0g/kg/d)肌酸1周后停止,动态观察内源性肌酸生物合成代谢途径中限速酶活力和主要代谢物质含量的变化。结果:大剂量、短时间补充肌酸引起的肾脏精氨酸-甘氨酸脒基转移酶(AGAT)活力下降,可在停补肌酸后8天内恢复正常;补充肌酸引起的肾脏和肝脏胍乙酸含量降低也分别于停补肌酸后4天和8天内恢复正常;补充肌酸导致的各组织器官肌酸含量升高均在8天内恢复正常,其中肾脏1天,血清3～4天,比目鱼肌4天,腓肠肌8天;升高的血清肌酐含量于1天内恢复正常。组织肌酸激酶(creatinekinase,CK)活力未受到补充肌酸的影响。结论:停止大剂量、短时间补充肌酸后,大鼠自身的肌酸生物合成到8天左右可逐渐恢复正常。这表明,大剂量、短时间补充肌酸对内源性肌酸合成的抑制作用可在去除抑制因素后较短时期内得到逆转。

精氨酸代谢途径抗酸关键基因对乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000胁迫抗性的影响

【目的】寻找精氨酸代谢途径中与酸胁迫相关的关键作用因素。【方法】通过在Lactococcus lactis NZ9000中分别过量表达来源于Lactobacillus casei Zhang的精氨酰琥珀酸合成酶(ASS)和精氨酰琥珀酸裂解酶(ASL)改变精氨酸代谢提高酸胁迫抗性。【结果】与对照菌株对比,重组菌株在环境胁迫下表现了较高的生长性能、存活率和发酵性能。生理学分析发现,酸胁迫环境下,重组菌株细胞有较高的胞内NH4+、ATP含量和H+-ATPase活性,并显著提高了精氨酸脱亚胺酶(ADI)途径中的氨基酸浓度。进一步的转录分析发现,天冬氨酸合成、精氨酸代谢相关的基因转录水平上调。【结论】在L.lactis NZ9000中过量表达ASS或ASL可以引发精氨酸代谢流量的上调,进而提高了细胞的多种胁迫抗性。精氨酸合成途径广泛存在于多种微生物中,为微生物,尤其是工业微生物提高胁迫抗性提供了新思路。

PRMT1结合并增强HMGCR活性对食管鳞癌细胞增殖能力的影响

目的探讨蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)结合羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)后活性变化及其对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。方法以食管鳞癌ECA109细胞为模型,通过免疫共沉淀法观察PRMT1与HMGCR在细胞中的相互结合作用。将ECA109细胞随机分为感染组和对照组,分别以表达特异性针对PRMT1的RNA干扰分子的慢病毒质粒转染48 h,采用Western blot法分别检测PRMT1、HMGCR蛋白及甲基化HMGCR蛋白,分光光度法检测HMGCR酶活性,CCK-8法检测细胞增殖活性。结果细胞裂解后的蛋白共沉淀复合物分别用抗PRMT1、HMGCR抗体捕获后,可检测到HMGCR、PRMT1蛋白条带。感染组和对照组ECA109细胞中PRMT1蛋白相对表达量分别为0.057±0.011和0.239±0.041(P<0.01),HMGCR蛋白相对表达量分别为0.175±0.031和0.184±-0.037(P>0.05)。感染组和对照组ECA109细胞甲基化HMGCR蛋白相对表达量分别为0.028±0.006、0.107±0.016,HMGCR相对活性分别为0.104±0.009、0.277±0.013,P均<0.01。感染组ECA109细胞培养24 h后,细胞增殖的OD_(450)值已低于对照组(P<0.05);培养48 h及72 h后,两组OD_(450)值差距进一步扩大(P均<0.01)。结论 PRMT1可通过结合HMGCR蛋白促进其甲基化途径增强HMGCR蛋白活性,进而促进食管鳞癌细胞的体外增殖能力。

ADMA对单核/巨噬细胞分化为泡沫细胞过程中ACAT-1表达的影响

目的观察不对称二甲基精氨酸(ADMA)对单核/巨噬细胞分化为泡沫细胞过程中酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶-1(ACAT-1)表达的影响。方法 1)THP-1单核细胞与160 nmol/L佛波酯(PMA)孵育48 h后,再与80 mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)孵育24 h,用油红O染色在光镜下鉴定细胞形态及变化。2)将THP-1单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞分别用20μmol/L ADMA干预24 h,酶法测泡沫细胞内胆固醇酯的含量,RT-PCR方法检测ACAT-1mRNA表达,Western blot方法检测其蛋白表达。结果 1)ADMA可显著增加泡沫细胞内胆固醇酯的含量。2)与THP-1单核细胞相比,巨噬细胞(P<0.05)、泡沫细胞(P<0.01)中ACAT-1 mRNA及蛋白表达增加;而与巨噬细胞相比,泡沫细胞中ACAT-1 mRNA及蛋白表达增加但无显著性差异。3)与各自的对照组相比,经ADMA作用后3种细胞中ACAT-1 mRNA及蛋白表达水平均增加(P<0.01)。结论 ADMA增加泡沫细胞内胆固醇酯的含量可能是通过上调ACAT-1的mRNA及蛋白表达来实现的。

分析脐血单个核细胞MUT、ASS1基因突变与新生儿遗传性代谢病易感性的研究

目的探讨脐血单个核细胞甲基丙二酸单酰CoA变位酶基因(MUT)、精氨酸琥珀酸合成酶基因(ASSI)突变与新生儿遗传性代谢病易感性的关系。方法选取2014年5月~2019年6月在本院妇产科分娩的16743例新生儿,均采集脐带血行单个核细胞MUT、ASS1基因检测,且行遗传性代谢病筛查,根据筛查、确诊结果将所有新生儿分为遗传性代谢病组(疾病组)与无遗传性代谢病组(对照组)。对比2组MUT、ASS1基因突变情况,并采用Logistic回归分析法分析脐血单个核细胞MUT、ASS1基因突变与新生儿遗传性代谢病易感性的关系。结果6743例新生儿中共检测出有28例伴有MUT基因突变,有24例伴有ASS1基因突变;16743例新生儿最终确诊为45例发生遗传性代谢病,发生率为0.27%,其中有22例伴有MUT基因突变,有17例伴有ASS1基因突变;疾病组早产、过期产、足月产、低出生体重、巨大儿、正常体重的占比与对照组对应各指标占比差异无统计学意义(P>0.05),疾病组MUT基因突变、ASS1基因突变、有家族史占比均明显高于对照组各对应指标占比(P<0.05),且经多因素Logistic回归分析显示,MUT基因突变、ASS1基因突变、家族史均是新生儿遗传性代谢病易感性的风险因素(OR=3.889、3.501、2.986,P<0.05)。结论脐血单个核细胞MUT基因突变、ASS1基因突变均可增加新生儿遗传性代谢病发病风险,临床中可在孕期通过检测MUT、ASS1基因情况而加强产前筛查,以减少缺陷患儿的出生。