棉花精氨酸脱羧酶基因GhADC1克隆与表达分析

以抑制性消减杂交(SSH)文库序列为基础,采用生物信息学和RT-PCR方法从陆地棉中克隆出精氨酸脱羧酶基因,命名为GhADC1,GenBank登录号为KC851856。该基因全长2954 bp,其中5'非翻译区477 bp,具有多个参与胁迫响应的顺式作用元件和一个编码8个氨基酸的微型编码序列(uORF);主编码区(mORF)2181 bp,共编码726个氨基酸,其中N端具有叶绿体定位信号肽。推测的GhADC1蛋白具有PLP结合位点及Orn/Dap/Arg脱羧酶的信号位点,属于典型的III型PLP依赖型精氨酸脱羧酶家族成员。荧光定量RT-PCR结果表明,正常条件下,GhADC1在叶片中表达量高于茎和根部组织,且在抗黄萎病品种冀棉20中的表达水平高于耐病品种中521;黄萎病菌胁迫能够快速诱导抗病品种根部GhADC1表达,而在耐病品种中未见明显差异,推测在抗病品种中GhADC1可能参与根部对黄萎病菌胁迫的早期应答。

枯草芽孢杆菌BJ3-2精氨酸脱羧酶基因speA的克隆与序列分析

根据GenBank中枯草芽孢杆菌168菌株的精氨酸脱羧酶基因speA序列设计特异性引物,提取Bacillus subtilis BJ3-2基因组DNA进行PCR扩增,并克隆至pGEM-T载体后测序。序列分析结果表明,Bacillus subtilis BJ3-2 speA基因ORF长为1 473 bp,可编码490个氨基酸,分子质量为53.53ku,基因登录号为KJ561348,与已报道枯草芽孢杆菌的speA基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达93%以上,精氨酸脱羧酶氨基酸序列系统进化树分析,发现Bacillus subtilis BJ3-2的ADC与Bacillus subtilis 168亲缘关系最近,属于典型的III型PLP依赖型鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族成员。speA基因序列分析及其蛋白保守结构域的分析,为有效控制水豆豉产品中生物胺含量的研究提供了理论依据。

茶树中精氨酸脱羧酶基因的cDNA克隆及序列分析

通过SMARTRACE PCR技术获得了茶树中精氨酸脱羧酶(ADC)的cDNA全长序列,并登录GenBank(登录号为JQ653274)。ADC基因cDNA全长为2 988 bp,开放阅读框(ORF)全长为2 163 bp,共编码720个氨基酸,编码的蛋白质的分子量为77.430 kDa,理论等电点为5.373,其序列中不存在卷曲螺旋结构。ADC蛋白为亲水性非分泌不稳定蛋白,不跨膜运动,无信号肽序列存在,共有41个可能的磷酸化位点,存在于叶绿体基质中,是细胞质蛋白。精氨酸脱羧酶的基因cDNA全长序列的获得,对于进一步研究精氨酸在茶树氮代谢中的作用及茶氨酸代谢途径提供基础。

枯草芽孢杆菌精氨酸脱羧酶基因speA的表达与蛋白纯化

根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ3-2的精氨酸脱羧酶(ADC)的编码基因spe A序列设计特异性酶切引物,克隆基因speA序列。测序结果显示,基因speA全长为1473 bp,编码490个氨基酸,分子质量为58 ku。基因spe A克隆至原核表达载体,获得重组菌pET28a-spe A/BL21,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,1.0 mmol/L的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)28℃诱导4 h,上清液和菌体均能表达出ADC蛋白,上清液经纯化、透析、冷冻干燥可获得纯度97%的ADC酶,酶联免疫吸附检测(ELISA)ADC酶活为16780 U/mg。为speA基因的表达、纯化及酶学性质研究奠定了理论基础。

番茄S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SlSAMDC1的克隆与序列分析

以蔓陀罗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶全长cDNA序列为信息探针,筛选NCBI番茄EST数据库,依据同源EST信息,经人工拼接、RT-PCR及RACE技术验证,获得了1个新的SAMDC基因家族成员,命名为SlSAMDC1(GenBank登录号:EF550528),并利用染色体步移技术克隆了879bp的上游调控区域。SlSAMDC1cDNA序列全长1847bp,5′-UTR和3′-UTR分别长523和241bp;存在3个ORF(微型uORF、小型uORF和主ORF),主ORF编码360个氨基酸的SAMDC酶原;SlSAMDC1基因组序列全长3648bp,有3个内含子,均位于5′-UTR,所有内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则。SlSAMDC1基因与其它植物来源SAMDC基因同源性较高,与人、大肠杆菌以及酵母的同源性较低。表达谱分析发现,SlSAM-DC1基因在番茄根、茎、叶、花蕾、果实等器官中均表达,果实中的表达量相对较高。生物信息学分析表明,SlSMDC1基因的上游调控序列存在多个顺式作用元件,如W-box、TATA-box、CAAT-box等。

苦豆子赖氨酸脱羧酶基因克隆与表达分析

赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,LDC)基因是苦豆子中氧化苦参碱(oxymatrine,OMA)生物合成的第一个关键酶基因。根据近缘物种苦参的赖氨酸脱羧酶基因设计特异引物,同源克隆法克隆了苦豆子赖氨酸脱羧酶基因的蛋白质编码区序列,全长1368bp,命名为Sa-LDC,GenBank登录号为KM249871。生物信息学分析表明SaLDC编码区序列无内含子,与苦参和狗苦参的LDC序列一致性均达到97%;属于Ⅲ型5-磷酸吡哆醛依赖酶[typeⅢpyridoxal 5-phosphate(PLP)-dependent enzymes,PLPDE-Ⅲ]超基因家族,功能活跃。Sa-LDC编码455个氨基酸残基,其编码的肽链相对分子质量49.14kD,理论等电点5.63,无信号肽和跨膜结构;在其氨基酸序列中具有产喹诺里西啶生物碱的特征性保守位点Phe^(340);系统进化树将苦豆子与其他产喹诺里西啶类生物碱的植物聚为一类。qPCR和HPLC检测显示,苦豆子赖氨酸脱羧酶基因的表达和氧化苦参碱的积累均受干旱胁迫的影响,且基因的表达量与氧化苦参碱的积累呈正相关关系。

棉花S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因(GhSAMDC2/3/4)的克隆及其诱导表达分析

利用电子克隆结合RT-PCR技术克隆获得陆地棉(Gossypium hirsutum L.)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因家族3个基因,分别命名为Gh SAMDC2、Gh SAMDC3和GhSAMDC4。序列分析显示,该基因c DNA包含的upstream ORF(u ORF)和main ORF(m ORF)为植物SAMDC基因特征ORF,其中m ORF长度分别为1068 bp、1110 bp和1032 bp,分别编码355、369和343个氨基酸。聚类分析表明,Gh SAMDC2/3蛋白与可可树(Theobroma cacao)SAMDC聚为一类,且Gh SAMDC2与GhSAMDC3蛋白亲缘关系最近;Gh SAMDC4与拟南芥At SAMDC4聚为一类。实时荧光定量PCR分析表明,Gh SAMDC2在茎中表达相对较高,随着纤维发育其表达量不断增加,在纤维发育后期其表达量达到最高;Gh SAMDC2/3/4在不同的胁迫条件下表现出不同的表达模式,Gh SAMDC2受低温和干旱胁迫诱导最强烈,Gh SAMDC3响应盐胁迫显著,Gh SAMDC4受ABA诱导强烈。上述结果为进一步研究棉花SAMDC基因功能奠定了一定基础。

花生幼苗内精氨酸脱羧酶的初步研究

花生体内控制多胺生物合成的主要酶是ＡＤＣ主要定位于代谢活跃的分生组织内。部分纯化（１３倍）的酶最适底物是Ｌ－Ａｒｇ，Ｋｍ值和Ｖｍａｘ依次为０．５６ｍｍｏｌ／Ｌ、０．６６μｌＣＯ２／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ．ｍｉｎ。反应最适ｐＨ和温度为８～８．５和４０～４５℃。该酶对热、乙醇、脲稳定性差。０．８ｍｍｏｌ／ＬＰＬＰ（磷酸吡哆醛）可提高酶活性２１％，ＤＴＴ（二硫苏糖醇）、ＭＥ（巯基乙醇）提高酶的稳定性，对氯苯汞甲酸酯抑制酶活７０％。说明ＡＤＣ可能以ＰＬＰ为辅酶，活性中心含有巯基。６－ＢＡ、ＧＡ３可明显提高酶活性。二价金属离子对酶活性影响很小。Ｓｐｄ（亚精胺）、Ｓｐｍ（精胺）和Ｐｕｔ（腐胺）均不同程度地降低酶活性，多胺的生物合成途经中可能存在反馈调节机制。

精氨酸及精氨酸脱羧酶抗体对痛阈及吗啡镇痛作用的影响(英文)

目的进一步阐明胍丁胺对阿片药理作用的影响。方法采用小鼠醋酸扭体法、小鼠热辐射甩尾法、小鼠热板法评价了精氨酸及精氨酸脱羧酶抗体对痛阈、吗啡镇痛及其耐受作用的影响。结果在小鼠醋酸扭体实验中,脑室注射精氨酸能剂量依赖性地抑制小鼠扭体次数,最大抑制率达84 %。在小鼠热辐射甩尾模型中,精氨酸不影响小鼠的甩尾时间,但能剂量依赖性地增强吗啡的镇痛作用,使吗啡2 .5 mg·kg-1的最大可能镇痛百分率从23 %增加到71 %。此外,在小鼠热辐射甩尾实验中,精氨酸能抑制吗啡100 mg·kg-1所诱导的急性耐受。精氨酸上述作用可被咪唑啉受体拮抗剂咪唑克生(3mg·kg-1,ip)所抑制。在小鼠热辐射甩尾实验和小鼠55℃热板实验中,精氨酸脱羧酶抗体能抑制吗啡镇痛,并能加重吗啡所致的耐受。结论上述结果提示,精氨酸及精氨酸脱羧酶在痛阈、吗啡镇痛及吗啡依赖形成过程中具有重要作用。

低温胁迫下褪黑激素对烟草悬浮细胞精氨酸脱羧酶活性的影响

研究了褪黑激素对烟草(Nicotiana tabacum)悬浮细胞在低温胁迫下精氨酸脱羧酶活性及细胞生存率的影响。发现褪黑激素可以明显提高低温胁迫下烟草悬浮细胞精氨酸脱羧酶的活性,并明显提高细胞的生存率。表明褪黑激素可能在低温条件下通过调节植物细胞内多胺的合成而提高抵御冷害的能力。

精氨酸脱羧酶和谷酰胺转移酶活性的测定方法

介绍了一种测定精氨酸脱羧酶和谷酰胺转移酶活性的方法———苯甲酰化 紫外检测 ,并鉴定了该方法的灵敏性。

马兜铃酪氨酸脱羧酶基因克隆、测序及同源性分析

[目的]从中草药马兜铃中获得酪氨酸脱羧酶基因(tyrDC)互补DNA(cDNA)序列并进行同源性分析,以进一步达 到敲除tyrDC,减轻该药肾毒性的目的。[方法]参照已知的植物酪氨酸脱羧酶的保守性氨基酸序列设计简并引物,并通过 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从马兜铃中扩增出cDNA片段。将扩增的cDNA序列克隆并测序,用以设计特异引物,并 通过cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)从马兜铃中扩增出全长tyrDC cDNA。[结果]该克隆的 tyrDC cDNA的总长度为1 678 bp,包括一个编码516个氨基酸的1 551bp开读框(ORF)和一段127 bp的下游非翻译区 (3'UTR)。序列比较结果表明,由马兜铃tyrDC核苷酸序列推导的氨基酸序列分别与已发布的罂粟酪氨酸脱羧酶和唐松草酪 氨酸／多巴脱羧酶享有76％和79％的同源性。[结论]从马兜铃中扩增得到tyrDC cDNA全序列,且对酪氨酸脱羧酶的同源检 索显示,不同植物的酪氨酸脱羧酶之间都存在普遍的序列相似性。为去除马兜铃肾毒性奠定了基础。

枯草芽孢杆菌BJ3-2赖氨酸脱羧酶基因yaaO的克隆与序列分析

根据Gen Bank中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株假定的赖氨酸脱羧酶基因(LDC)序列设计同源引物,提取枯草芽孢杆菌BJ3-2基因组DNA进行PCR扩增,并克隆至p GEM-T载体后测序。序列分析结果表明:Bacillus subtilis BJ3-2 yaa O基因开放阅读框(ORF)长为1 443 bp,获得基因登录号为KJ561349,BLAST比对与已报道枯草芽孢杆菌的yaa O基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性均高达90%以上,对赖氨酸脱羧酶氨基酸序列构建系统进化树分析,发现Bacillus subtilis BJ3-2的LDC与B.subtilis JS亲缘关系最近,SWISS-MODEL预测该蛋白的3D结构与鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶蛋白相似性为39.22%,属于典型的III型磷酸吡哆醛(PLP)依赖型鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族成员。yaa O基因序列分析及氨基酸保守结构域的分析,为有效控制水豆豉产品中尸胺含量过高的研究提供了理论基础。

中国对虾甘氨酸脱羧酶的基因克隆、表达及其与抗WSSV的关联分析

本研究采用RACE技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)甘氨酸脱羧酶基因(Fc GLDC)的全长cDNA及DNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,FcGLDC基因的cDNA全长为3481 bp,其中,ORF为2829 bp,5￠UTR长17 bp,3￠UTR长86 bp。完整的阅读框编码942个氨基酸,分子量为104.66 kDa,预测的理论等电点为6.51。FcGLDC基因DNA序列全长共4964bp,包含12个外显子和11个内含子。同源性及系统进化分析显示,FcGLDC基因与节肢动物的GLDC基因聚为一类;氨基酸序列比对发现,Fc GLDC基因的蛋白序列与节肢动物的相似度最高,与内华达白蚁(Zootermopsis nevadensis)、体虱(Pediculus humanus corporis)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)的相似度分别为71%、68%和68%。在鳃、肝胰腺和肌肉中的荧光定量PCR结果显示,FcGLDC在肌肉中的相对表达量最高,鳃中最低。WSSV感染后,该基因在鳃、肝胰腺和肌肉中呈现出了不同的时空表达特点。使用直接测序法结合质谱法,在该基因内部发现4个SNP位点,但是各位点与抗WSSV性状均不相关(P>0.05)。本研究表明,FcGLDC基因在对虾感染WSSV后的应答反应中或起一定作用。

苦瓜果实S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因McSAMDC的克隆、表达及亚细胞定位

根据已构建苦瓜果实均一化文库中获得的1个与SAMDC基因相关的EST序列,采用3′RACE技术,克隆获得1个苦瓜SAMDC基因的cDNA全长序列,命名为McSAMDC(GenBank登录号为KC632099)。生物信息分析结果表明,该cDNA全长1 900 bp,5′UTR和3′UTR分别长501、325 bp。该cDNA序列存在3个开放读码框(微型tORF、上游读码框uORF和主读码框mORF),其中mORF长1 077 bp,编码358个氨基酸,预测分子量为39.31 ku,含有酶原剪切位点结构域和蛋白快速降解有关的PEST二个保守结构域。二级结构分析显示,McSAMDC含有无规卷曲(45.53%)、α-螺旋(29.33%)、伸展链(19.83%)、β-转角(5.31%)。序列分析结果表明,McSAMDC与拟南芥(CAA69073.1)、琴叶拟南芥(XP 002882231.1)和雪里红(AAS45435.1)的氨基酸序列相似性分别达到69%、68%和68%。亚细胞定位结果表明,McSAMDC定位在细胞质中。荧光定量结果表明,McSAMDC在果实膨大期表达量最高,并随之迅速下降,并从成熟初期至完全成熟期该基因表达量逐渐增大。

聚合酶链反应检测乳酸菌酪氨酸脱羧酶基因

酪氨酸脱羧酶与乳酸菌发酵食品中酪胺的产生密切相关。根据从GenBank中检索到的酪氨酸脱羧酶基因序列设计一对特异性引物,采用PCR技术对乳酸菌的基因组DNA片段进行扩增,以此建立以酪氨酸脱羧酶基因为靶的产酪胺乳酸菌的分子生物学检测方法。结果表明,供试12株乳酸菌中有9株菌扩增出1133bpDNA片段。对其中3株菌的扩增产物进行DNA序列测定,测序结果采用国际互联网上NCBI的BLAST工具进行同源性检索分析,发现它与已知的Enterococcusfaecalis,Enterococcusfaecium,Carnobacteriumdivergens的酪氨酸脱羧酶基因序列均高度同源,其中PLP(5'-磷酸吡哆醛)的结合位点高度保守,证明该扩增产物是酪氨酸脱羧酶的基因片段。应用该法与常规平板检测法比较显示,二者检测结果基本一致,表明本研究建立的PCR方法可作为一种快速、高度特异的检测产酪胺乳酸菌菌株的新方法。

马鲛鱼中精氨酸脱羧酶的基因克隆及生物信息学分析

本研究以马鲛鱼贮藏期内腐败产胺菌-霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)为研究对象,通过基因工程和生物信息学多种分析方法,探究马鲛鱼种霍氏肠杆菌精氨酸脱羧酶的理化性质。通过T-A克隆并测序得到ADC基因,将其翻译成蛋白序列,然后预测蛋白质一级结构、二级结构以及三维构象,分析ADC蛋白质的理化性质及其功能。结果显示:ADC蛋白由93个氨基酸构成,预估分子量大小约为10.82 ku、理论等电点是8.64、原子组成为C_(492)H_(746)N_(136)O_(135)S_(3)、半衰期>10 h(大肠杆菌,体内)、脂肪系数是86.02;总平均亲水性是-0.35整体表现为亲水性,是可溶性蛋白;不稳定系数为48.57,且ADC蛋白不存在信号肽,不是分泌蛋白。这些结果以及同时预测的ADC蛋白的二级结构和三维构象,为后续的深入研究提供参考,今后在基因克隆的基础上,将进行蛋白质的表达、分离纯化和性质研究,进一步解析精氨酸脱羧酶。

精氨酸脱羧酶活性与冬小麦抗旱性关系的研究初报

多胺(Polyamine)是生物体代谢过程中产生的具有生物活性的低分子量脂肪族含氮碱。常见的有腐胺、尸胺、亚精胺和精胺等。近年来发现多胺是一类重要的代谢调节物质,直接或间接地影响着细胞的生命活动[1、3]。特别是当任何组织的生长速率有显著改变时,多胺的含量也发生相应的改变[2、3、4]。植物体内的腐胺、亚精胺主要是由精氨酸脱羧进一步转化而来的[1、2、3、5、8]。精氨酸脱羧酶(ADC,EC.4.1.1.19)是多胺生物合成的限速酶。

酪氨酸羟化酶和左旋芳香族氨基酸脱羧酶基因的细胞表达及活性检测

由于在帕金森病中合成多巴胺所需的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和左旋芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic L-amino acid decarboxylase,AADC)活性明显降低,所以补充多巴胺合成酶成为基因治疗帕金森病研究的主要手段。我们分别构建了重组逆转录病毒载体pLHCX/TH及pLNCX_2/AADC,通过脂质体介导将带有目的基因的载体分别转到包装细胞PA317中,经筛选得到产病毒的细胞PA317/TH和PA317/AADC,采用免疫组化、原位杂交方法检测目的基因表达;细胞经裂解后进行的酶促反应产物多巴胺以高压液相电化学方法检测证明所克隆的TH及AADC基因具有功能活性;这两种基因工程改造细胞可以完成酶促动力学的功能,使L-dopa及多巴胺产生明显增加。本研究为用TH和AADC双基因对帕金森病进行基因治疗提供了一定的依据。

甘氨酸脱羧酶基因增强子区(-4.2^-2.2 kb)基因图谱绘制及其活性检测

目的绘制鸡甘氨酸脱羧酶基因的增强子(-4. 2^-2. 2 kb)区域图谱并检测其活性。方法利用多种限制性内切酶绘制甘氨酸脱羧酶基因的增强子区域,构建甘氨酸脱羧酶截断体的荧光素酶报告基因,瞬时转染肝癌细胞HepG2检测荧光素酶活性。结果 GDC基因5’端上游-4200^-2200区域含有KpnⅠ;HincⅡ;EcoRⅠ;HindⅢ;PstⅠ;XbaⅠ限制性内切酶识别位点;荧光素酶报告基因检测发现KX全长和HDHI/L,HIK两种截短体活性明显高于空载体,其余截短体活性无明显变化或降低。结论 GDC基因5’-端区域-4200/-2200基因片段具有抑制或激活GDC启动子活性的能力。