表达谷胱甘肽S转移酶-蜂毒素-^(88)精氨酸变体白细胞介素2工程菌的发酵条件研究

目的研究重组蜂毒素-88精氨酸变体白细胞介素2(Melittin-88ArgIL-2)工程菌的发酵条件。方法采用摇瓶发酵,对含pGEX-4T-2-Melittin-88ArgIL-2重组质粒的工程菌进行诱导表达,研究诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、培养基的pH值等对谷胱甘肽S转移酶-Melittin-88ArgIL-2表达量的影响。同时研究培养温度对产物表达形式的影响。结果根据优化的条件,蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的36%左右。结论确立了该重组melittin-88ArgIL-2工程菌的发酵条件。

含精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰序列短肽的合成及应用研究进展

精氨酰 -甘氨酰 -天冬氨酸 (RGD)是具有生物活性的短肽序列之一。它是大多数细胞表面粘附分子能识别的配体上的最小氨基酸序列 ,在内皮细胞的识别、抗血栓、抑制肿瘤 ,治疗烧伤和皮肤溃疡等方面具有重要的作用。本文综述了近年来国内外对含RGD序列短肽的合成及其应用研究进展。

神经元型一氧化氮合酶在Ⅱ组代谢型谷氨酸受体介导的脑缺血耐受中的作用

目的:探讨神经元型一氧化氮合酶(nNOS)催化产生的一氧化氮(NO)在Ⅱ组代谢型谷氨酸受体(mGluR2/3)介导的脑缺血预处理(CIP)保护机制中的作用。方法:36只永久凝闭椎动脉的SD大鼠随机分为6组(n=6):sham、CIP、损伤性缺血、CIP+损伤性缺血、MTPG+CIP和MTPG+CIP+损伤性缺血组。采用硫堇染色和免疫组化观察海马CA1区迟发性神经元死亡(DND)和nNOS表达的变化。结果:与Sham组相比,CIP组海马nNOS表达出现一定程度的上调,而损伤性脑缺血组则出现nNOS表达的明显上调,预先给与CIP可一定程度上防止损伤性脑缺血所致的nNOS表达的过度升高。在MTPG+CIP组,预先侧脑室注射mGluR2/3阻断剂MTPG,可阻断CIP引起的nNOS表达增加,但对神经元的存活无影响。而在MTPG+CIP+损伤性缺血组中,出现大量锥体神经元DND,同时nNOS的表达较MTPG+CIP组明显增加,该增加为损伤性脑缺血所致,而非MTPG的作用。结论:nNOS催化产生的NO作为mGluR2/3的下游分子参与脑缺血预处理过程中mGluR2/3介导的脑缺血耐受的形成。

诱生型一氧化氮合酶在代谢型谷氨酸受体参与老年性痴呆发病中的作用

目的观察诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric-oxide synthase,iNOS)在Ⅱ组代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor 2/3,mGluR2/3)参与老年性痴呆(AD)发病过程中的可能作用。方法将48只SD大鼠随机分为假手术组、AD组和AD+α-甲基-(4-四唑基-苯)甘氮酸(α-methyl-4-tetrazolyl-phenyl,MTPG)组3组,每组16只。AD组与AD+MTPG组经SD大鼠左侧脑室注入凝聚态Aβ25-35制做AD大鼠模型,假手术组以相同操作注射等量蒸馏水。1周后,AD+MTPG组于右侧脑室注射MTPG,AD组和假手术组注射等体积人工脑脊液。5周后取脑组织,应用硫堇染色、免疫组化和原位杂交方法,观察大鼠海马CA1区锥体神经元损伤情况,以及iNOS和iNOS mRNA表达。结果 (1)硫堇染色结果显示:假手术组海马CA1区锥体神经元轮廓清楚,排列整齐;AD组与假手术组相比,锥体神经元数目较少,轮廓欠清,形态不规则;AD+MTPG与AD组相比,神经元形态明显恢复,排列较规则。(2)免疫组化结果显示:假手术组神经元胞质有较弱的iNOS表达;AD组iNOS表达较假手术组明显增强;AD+MTPG iNOS表达较AD组减弱。(3)原位杂交结果显示:3组iNOS mRNA与iNOS表达呈相似的变化趋势。结论 iNOS在mGluR2/3参与AD发病过程中具重要作用。

环磷酰胺激活小鼠肝微粒体谷胱甘肽S-转移酶Ⅰ的机制研究

目的探讨环磷酰胺(CP)在体内对小鼠肝微粒体谷胱甘肽S-转移酶Ⅰ(mGST-Ⅰ)活性的影响及其可能的机制。方法用苯巴比妥75 mg·kg-1诱导小鼠CYP2B后,ip CP,测定9 h内mGST-Ⅰ酶活性,观察二巯基丁二醇(DTT)对酶激活的逆转作用和巯基烷化剂N-乙基马来酰亚胺(NEM)对酶再激活效应,用SDS-PAGE和负染凝胶法评价CP对mGST-Ⅰ蛋白表达的影响。结果 CP引起小鼠微粒体中mGST-Ⅰ活性增加;NEM在mGST-Ⅰ半胱氨酸-49-巯基(cys-49-SH)上的活化效应减弱,而CP引起的mGST-Ⅰ激活效应不被二硫键还原剂DTT逆转。激活的mGST-Ⅰ电泳图谱未见蛋白分子量变迁及蛋白表达增加。结论大剂量CP致mGST-Ⅰ激活效应机制主要是酶分子cys-49-SH上单个巯基的修饰作用。

Ⅱ组代谢型谷氨酸受体阻断剂对老年痴呆大鼠模型脑内nNOS及nNOS mRNA表达的影响

目的阐明Ⅱ组代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor2/3,mGluR2/3)对老年性痴呆(AD)发病过程中一氧化氮(NO)的影响。方法应用免疫组化和原位杂交方法,观察脑室应用Ⅱ组mGluR2/3阻断剂α-甲基-(4-四唑基-苯)甘氨酸(MTPG)对脑室β-淀粉样肽(Aβ)注射所致的AD大鼠神经型一氧化氮合酶(nNOS)及其mRNA表达的影响。48只SD大鼠随机分为假手术组、痴呆组、痴呆组+MTPG组,每组16只。各组大鼠均在Morris水迷宫测试后常温饲养1w后取材观察。结果假手术组海马CA1区锥体细胞轮廓清楚,排列整齐,胞浆有较弱的nNOS表达。痴呆组nNOS表达较假手术组明显增加,同时锥体细胞数目变少,锥体神经元的轮廓、形态出现明显的损伤性改变;脑室注射mGluR2/3阻断剂MTPG,可部分阻断AD引起的nNOS表达增加,对神经元的形态也有恢复作用。原位杂交与免疫组化显示相似的变化趋势。结论mGluR2/3参与AD发病过程,NO信号通路可能发挥重要作用。

转导血红素氧合酶-1蛋白减轻脑缺血/再灌注沙土鼠海马神经元的损伤

目的评价血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白转导对脑缺血/再灌注损伤沙土鼠海马神经元的影响。方法构建11R(11个精氨酸残基)-HO-1蛋白,50只沙土鼠随机分为5组(n=10):脑缺血/再灌注组(C组),沙土鼠行脑缺血/再灌注损伤。脑缺血/再灌注+生理盐水组(S组)、脑缺血/再灌注+11R组(R组)、脑缺血/再灌注+5 mg·kg-111R-HO-1组(H1组)和脑缺血/再灌注+25 mg·kg-111R-HO-1组(H2组),各组沙土鼠腹腔分别注射5 mg·kg-1生理盐水、5mg·kg-111R蛋白、5 mg·kg-111R-HO-1蛋白或25 mg·kg-111R-HO-1蛋白,3 h后行脑缺血/再灌注损伤。24 h后取沙土鼠海马,电镜下观察海马组织线粒体的变化,检测海马神经元凋亡、Caspase-3和HO-1蛋白表达、cAMP水平。结果C组、S组和R组3组间海马神经元线粒体变性率、神经元凋亡率、Caspase-3和HO-1蛋白表达、cAMP水平变化无差异(P>0.05);H1组海马神经元线粒体变性率降低、神经元凋亡率降低、Caspase-3蛋白表达下调、HO-1蛋白表达上调、cAMP水平升高(vs C组、S组和R组,P<0.01);H2组海马神经元线粒体变性率降低、神经元凋亡率降低、Caspase-3蛋白表达下调、HO-1蛋白表达上调、cAMP水平升高(vs H1组,P<0.01)。结论 HO-1蛋白转导减轻了脑缺血/再灌注沙土鼠海马神经元的损伤。

四型肽精氨酸转亚胺基酶功能基因多态性及其表达与类风湿关节炎相关性研究

目的探讨四型肽精氨酸转亚胺基酶（PADI4）功能基因多态性及其表达与类风湿关节炎（RA）的相关性。方法采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测70例RA患者、81名健康对照者外周血单个核细胞（PBMC）中PADI4基因的表达水平，采用DNA测序和TA载体克隆方法分析PADI4基因外显子内第89、90、92、104位点单核苷酸多态性（SNPs）。结果4个SNPs中除了PADI4_92位点外，携带PADI4少见等位基因者发生RA的易感性显著高于携带常见等位基因者；在所研究对象中分别由4个位点上的常见等位基因（ACCC）和少见等位基因（GTGT）组成的功能基因型为主要基因型。与ACCC型比较，携带GTGT型者发生RA危险性显著增高（P〈0．01）。RA组PADI4基因表达水平显著高于正常对照组（P〈0．05），并且在RA组和对照组中携带PADI4少见等位基因者PADI4的表达水平显著高于携带常见等位基因者。结论PADI4功能基因多态性及其基因表达与中国人RA易感性相关，PADI4功能基因多态性影响基因表达。

1,4-二巯基苏糖醇对溶菌酶淀粉样纤维化的抑制作用

蛋白质淀粉样纤维化是很多人类疾病的重要特征,筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂对于研究和开发相关疾病的治疗药物具有重要意义。本文采用溶菌酶作为模型,探索巯基化合物1,4-二巯基苏糖醇(DTT)对蛋白质淀粉样纤维化的抑制作用。结果表明,DTT对溶菌酶淀粉样纤维化具有较强的抑制作用,其IC50数值为17μmol.L-1。DTT抑制溶菌酶纤维化的作用与其巯基结构有关。在溶菌酶分子高级结构改变产生聚集和纤维化的过程中,DTT分子的巯基通过与溶菌酶的二硫键作用改变了多肽的构象,从而改变了溶菌酶纤维化的进程。

补充大剂量肌酸抑制运动训练大鼠内源性肌酸的合成

目的:探讨补充大剂量肌酸对运动大鼠自身肌酸生物合成和体内肌酸代谢的影响。方法:给游泳训练大鼠补充肌酸,测定大鼠肾脏精氨酸-甘氨酸脒基转移酶(AGAT)活性、酶促反应产物胍乙酸含量、骨骼肌肌酸含量、血清肌酸和肌酐含量、血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性、大鼠游泳力竭时间。结果:补充超大剂量(6 .0g/kg/d)肌酸可引起大鼠腹泻,造成腓肠肌和比目鱼肌湿重显著下降(P <0 .0 5 ) ;补充相当于人体冲击剂量(1 5g/kg/d)和超大剂量肌酸,均可引起运动大鼠肾脏AGAT活性和肝脏胍乙酸含量明显下降(P <0 . 0 1) ;超大剂量补充肌酸引起游泳大鼠血清肌酐含量增加。此外,运动训练能提高肾脏AGAT活性和肝脏胍乙酸含量,促进内源性肌酸的合成。结论:超大剂量补充肌酸可抑制运动机体内源性肌酸的合成。建议实践中不宜超量超时补充肌酸,有必要对人体补充肌酸的冲击剂量(0 . 3g/kd/d或2 0g/d)的健康安全性进行深入研究。

大剂量、长时间补充肌酸对大鼠自身肌酸生物合成的影响

目的 :探讨大剂量、长时间补充肌酸对大鼠自身肌酸生物合成过程和肌酸代谢的影响。方法 :测定不同剂量补充肌酸 4周后大鼠肾脏的精氨酸 -甘氨酸脒基转移酶 (AGAT)活性和酶促反应产物胍乙酸含量、骨骼肌肌酸含量、血清肌酸激酶活性和肌酐水平。结果 :补充 4周不同剂量的肌酸后 ,大鼠体重有增加的趋势 ,同时腓肠肌湿重显著增加 (P <0 0 5 ) ,但 6 0g/kg组大鼠的体重和腓肠肌湿重低于其它剂量组。肾脏AGAT活性和胍乙酸含量有不同程度的降低 (P <0 0 1) ,补充剂量越大 ,降低程度越明显。结论 :大剂量、长时间补充肌酸可显著影响内源性肌酸的合成。超大剂量补充肌酸还会造成腹泻和骨骼肌量丢失。研究结果提示 ,补充肌酸应适量适时 ,不可长时间大剂量或超大剂量使用。

常规方法(冲击量+维持量)补充肌酸对运动训练大鼠内源性肌酸合成影响的动态观察

目的:动态观察常规方法(冲击量+维持量)补充肌酸对运动训练大鼠自身肌酸生物合成和代谢的影响。方法:将60只大鼠按体重随机分为6组:3组为补充肌酸组,分别以冲击量(1.5g/kg/d)1周、冲击量(1.5g/kg/d)1周+维持量(0.15g/kg/d)4周和冲击量1周+维持量(0.15g/kg/d)8周补充肌酸;其余3组为相应对照组。各组大鼠每天进行游泳训练4小时。分别于实验1周、5周、9周后测定大鼠肾脏精氨酸-甘氨酸脒基转移酶(AGAT)活性,肾脏、肝脏和血清胍乙酸(GA)含量,肾脏、骨骼肌和血清肌酸含量,血清和骨骼肌肌酸激酶(CK)活性及血清肌酐水平。结果:冲击量补充肌酸可导致运动训练大鼠肾脏AGAT活性以及肾脏、肝脏和血清胍乙酸含量降低,随着维持期延长,上述指标逐步恢复至对照组水平。补充肌酸引起肾脏肌酸含量明显增加,肾脏和血清肌酸含量与AGAT酶活性呈明显负相关。结论:冲击量补充肌酸可抑制运动训练大鼠内源性肌酸的合成,而在维持量阶段抑制状态逐渐缓解。建议运动员补充肌酸时不使用冲击剂量而只使用维持剂量。

常规方法(冲击量+维持量)补充肌酸对内源性肌酸合成代谢的影响

目的:探讨常规方法(冲击量+维持量)补充肌酸对大鼠自身肌酸生物合成代谢的影响。方法:冲击剂量(1.5g/kg/d)补充肌酸1周和维持剂量(0.15g/kg/d)补充肌酸1月、2月后,分别测定大鼠肾脏精氨酸-甘氨酸脒基转移酶(AGAT)活性,肾脏和肝脏胍乙酸含量,肾脏、骨骼肌和血清肌酸含量,血清和骨骼肌肌酸激酶(CK)活性及血清肌酐水平。结果:冲击量及维持量补充肌酸均可导致大鼠肾脏AGAT活性以及肾脏和肝脏胍乙酸含量降低,引起肾脏肌酸含量明显增加,肾脏和血清肌酸含量与AGAT酶活性呈明显负相关。冲击期血清肌酐水平显著升高,但在维持期恢复正常。结论:常规方法(冲击量+维持量)补充肌酸可显著抑制内源性肌酸的合成。

长期(8个月)补充肌酸对大鼠内源性肌酸合成的影响

目的:探讨长期(8个月)补充肌酸对大鼠内源性肌酸合成的影响。方法:21天龄雄性SD大鼠连续补充0.35g/kg/d肌酸(肌酸组)或对照液(对照组)8个月,观察其内源性肌酸生物合成途径中L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶(AGAT)活性和主要代谢物质含量的变化。结果:8个月后,与对照组相比,肌酸组大鼠肾脏L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶活性显著降低,肾脏、肝脏和血清胍乙酸含量较低;肾脏、肝脏、血清和腓肠肌肌酸含量变化不明显,比目鱼肌和跖肌肌酸含量显著升高;肾脏结构、血清肌酐含量和骨骼肌肌酸激酶活性等均无显著性差异。肾脏AGAT活性与肾脏肌酸含量和血清肌酸含量均无显著相关关系(P>0.05)。结论:长期补充0.35g/kg/d肌酸可抑制大鼠内源性肌酸合成,提高骨骼肌肌酸含量,但不会对肾脏结构产生影响。

补充肌酸对生长发育期雌、雄大鼠内源性肌酸合成的影响

目的:探讨补充肌酸对生长发育期雌、雄大鼠内源性肌酸合成的影响,为不同群体合理使用肌酸提供实验依据。方法:21天龄雌性和雄性SD大鼠随机分为5组,每组雌、雄大鼠各6或7只,分别连续补充0(对照液)、0.15、0.35、0.75或1.5g/kg/d肌酸液8周。观察内源性肌酸合成代谢途径中L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶(AGAT)活性和其它主要指标的变化。结果:与相同性别对照组相比,雌性或雄性大鼠补充肌酸8周后,肾脏AGAT活性和肝脏胍乙酸含量均降低,且补充肌酸剂量越大,降低越明显;腓肠肌、跖肌和比目鱼肌肌酸含量、血清肌酐含量升高;肾脏结构无明显差异。补充相同剂量肌酸的雄性大鼠肾脏AGAT活性和肝脏胍乙酸含量均高于雌性大鼠。结论:补充肌酸对生长发育期雌性或雄性大鼠的内源性肌酸合成均有抑制作用。雌性大鼠内源性肌酸合成能力弱于雄性。补充肌酸有助于提高骨骼肌肌酸含量。大剂量(1.5g/kg/d)补充肌酸不会对肾脏结构产生明显影响。

补充肌酸及间歇性运动对大鼠内源性肌酸合成的影响

目的:探讨补充大剂量肌酸对运动大鼠自身肌酸合成的影响.方法:补充肌酸的大鼠进行短时间大强度的间歇性跑台运动,观察对肾脏精氨酸-甘氨酸脒基转移酶(AGAT)活性、胍乙酸含量、骨骼肌肌酸含量和血清肌酸含量的影响.结果:补充相当于人体冲击剂量(1.5 g/kg/d)的肌酸对短时间大强度运动的大鼠肾脏AGAT活性和肝脏胍乙酸含量并不产生明显的影响;而补充超大剂量肌酸,均可引起运动大鼠肾脏AGAT活性和肝脏胍乙酸含量明显下降(P<0.01);超大剂量补充肌酸引起运动大鼠血清肌酐含量增加(P<0.01).

表面修饰对羟基磷灰石修复骨缺损的影响

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）多肽是介导种子细胞与支架材料黏附的多肽链．RGD序列可被固有黏附蛋白受体特异性结合．在生物材料表面自发形成一分子层．为与受体介导的种子细胞提供特异性位点而促进细胞的黏附和分化。笔者旨在应用RGD多肽对羟基磷灰石（hydroxyapatite．HA）材料进行表面修饰处理．以促进骨髓基质干细胞（marrow stromal cells．MSC）在其表面的黏附和生长．为骨组织工程提供一种支架材料的表面修饰手段。

YIGSR抑制骨肉瘤细胞分泌MMP-2和MMP-9的实验研究

[目的]研究酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸五肽(YIGSR)对人骨肉瘤细胞MG-63分泌基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的抑制作用。[方法]在MG-63细胞中加入0、50、100μg/ml的YIGSR,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫组化和明胶酶谱分析检测MMP-2和MMP-9的变化。[结果]免疫组化结果显示随YIGSR剂量增加,MMP-2、MMP-9平均光度递减,胞浆着色变浅;RT-PCR结果显示,随YIGSR剂量增加,MMP-2、MMP-9对应电泳条带亮度逐渐减弱;明胶酶谱分析也表明,随YIGSR剂量的增加,负染条带平均光度越来越低。结果均有显著性差异(P<0.05)。[结论]YIGSR能有效抑制人骨肉瘤细胞MG-63分泌MMP-2和MMP-9,在抑制骨肉瘤的侵袭与转移中可能会发挥一定作用。

RGD脂肪醇与17-AAG脂质体的制备及抗肿瘤活性研究

目的制备一种新的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-脂肪醇(Arg-Gly-Asp-Phe-fatty alcohol,RGDFOC12)与17-丙烯氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG)的脂质体(RGDFOC12liposomes-loaded 17-AAG,RLAs)。方法采用薄膜分散-探头超声法制备;采用激光纳米粒度仪、透射电镜和扫描电镜测定粒径,Zeta电位和外观形态;采用动态透析法测定药物释放;采用四甲基偶氮唑盐〔3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT〕考察其对5种人肿瘤细胞株增生的抑制作用;通过瘤质量、存活数、体质量、脏器指数比评价其在小鼠体内抗肿瘤效果。结果制备得到的RLAs的粒径为(130.6±0.6)nm,Zeta电位为(-28.37±1.67)m V,外观形态为球形,包封率为80%以上。RLAs在p H 5.4环境的累积释放百分数大于在p H 7.4环境的累积释放百分数。RLAs在血浆中可稳定存在,12 h累积释放百分数为(15.85±0.71)%。RLAs对5种肿瘤细胞有抑制增生作用。RLAs对接种S180腹水瘤的ICR小鼠有抑制肿瘤生长作用。结论本研究制备了一种新的RLAs,制备方法简单、包封率高,具有较好的抗肿瘤活性。

^(99m)Tc-RGD肽荷人神经胶质瘤裸鼠显像的试验研究

整合素αvβ3是一种细胞外基质（extrocelluralmatrix,ECM）黏附受体,生理情况下整合素受体为细胞非组成性表达,而在新生血管内皮细胞及肿瘤细胞表面高表达[1]。整合素αvβ3受体在肿瘤生长和转移过程中的高度限制表达,使其成为一个非常有吸引力的靶点,用于肿瘤的诊断和治疗[2]。αVβ3受体通过与ECM蛋白识别含有三肽序列的RGD肽（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）特异性结合[3],这一理论为设计含有RGD肽序列的配体,用作选择性肿瘤靶向受体显像奠定了理论基础。