抗人精浆蛋白单链抗体基因的构建及序列分析

目的：构建抗人精浆蛋白的单链抗体基因，可为进一步构建、表达抗人精浆蛋白单链抗体／羧肽酶Ａ融合蛋白，用于前列腺癌的抗体导向酶－前体药物疗法奠定基础。方法：利用加端ＰＣＲ技术，在已克隆的抗人精浆蛋白单克隆抗体ＶＨ和Ｖκ基因两端加上限制性酶切位点，再分别克隆入载体ｐＵＣ１９－ｌｉｎｋｅｒ中，构建ＶＨ－ｌｉｎｋｅｒ－Ｖκ形式的Ｅ４Ｂ７单链抗体基因。利用全自动荧光测序仪测定其序列，采用ＰＣ／Ｇｅｎｅ软件与已知的ＶＨ和Ｖκ基因进行核苷酸序列的同源性比较，并推导其编码的氨基酸序列。结果：Ｅ４Ｂ７单链抗体基因全长为７４１ｂｐ，为一开放读框，编码２４７个氨基酸，与已知的抗人精浆蛋白单克隆抗体ＶＨ和Ｖκ基因完全同源。ＶＨ和Ｖκ间有４５ｂｐ的ｌｉｎｋｅｒ序列，推导的氨基酸序列为（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３，与设计的序列相符。结论：构建成功序列正确的抗人精浆蛋白单链抗体基因，为构建。

抗γ-精浆蛋白特异性单链抗体的RTS表达及其生物学活性的检测

目的：制备人精浆蛋白特异性单链抗体,并检测其生物活性与靶向性。方法：应用快速翻译系统(RTS)表达γ-精浆蛋白特异性单链抗体,制备E4B7ScFv肽段和纳米颗粒偶联物,应用免疫沉淀反应、Western Blotting法、免疫荧光染色分析和细胞实验,研究该抗体进入前列腺癌细胞的活性。结果：成功地制备了抗γ-精浆蛋白特异性单链抗体纳米颗粒偶联物。该抗体可与前列腺癌细胞特异性结合,并可在15 min内将纳米磁珠带入前列腺癌细胞内,进入癌细胞的磁球数量随着细胞培养时间的延长而增多,对照实验显示该偶联物不能进入其它组织肿瘤细胞。结论：制备的抗γ-精浆蛋白特异性单链抗体生物活性与靶向性均较好,在前列腺癌的早期核磁共振显像诊断与靶向治疗上具有潜在的应用价值。

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析

目的 扩增出抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单克隆抗体 (mAb)的重链可变区 (VH)单域抗体基因 ,并进行原核表达及空间构象分析。方法 从分泌抗γ SmmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,经RT PCR扩增VH 单域抗体基因 ,将其克隆到融合蛋白表达载体 pGEX 4T 1中进行表达 ,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果 VH 单域抗体基因全长 363bp ,含起始码和终止码。将其克隆到 pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5α ,获得高效表达 ,表达量占全菌总蛋白质的 38% ,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后 ,用谷胱甘肽 (GST)亲和色谱纯化 ,再经凝血酶水解获得抗γ SmVH 单域抗体。竞争结合抑制实验证明 ,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示 ,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论 构建成功抗γ Sm的VH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。

精子功能相关精浆蛋白质的蛋白组学研究进展

精浆蛋白质对生殖过程中的精子功能有显著影响,包括顶体反应、精子获能、精子贮存、精子竞争和受精。精浆蛋白质的研究已有很长的历史,而且牛精浆蛋白、热休克蛋白、富含半胱氨酸分泌蛋白等几种主要的精浆蛋白质已被成功分离鉴定。蛋白质组学研究方法和技术的迅速发展,为全面解析精浆蛋白质组提供了新的研究策略,提高了研究者探索精浆蛋白质未知领域的效率。作者综述了精子功能相关精浆蛋白质研究的相关信息及近年来精浆蛋白质组的研究进展,从蛋白质水平上阐述了精浆蛋白质与精子获能、贮存及受精等功能的关系。

弱精不育患者与正常生育能力者精浆蛋白质的双向电泳图谱分析

目的:探讨2-DE技术在人类正常与弱精不育者精浆全蛋白中筛选差异蛋白的应用。方法:先用IPG-DALT技术对12例弱精不育与5例正常精浆蛋白进行分离,银染后,经PDQUest2D比较二者间差异蛋白点。结果:在不育精浆中高丰度存在而正常精浆中低表达的有55个蛋白斑点(3个在正常缺失),在正常精浆中存在而在不育精浆中低表达的有43个(3个在不育缺失)。结论:成功建立了正常与弱精不育精浆蛋白的2-DE图谱并分析表达差异蛋白,为弱精症精浆差异表达蛋白的质谱鉴定奠定了基础。

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体/人p53四价功能域融合基因的构建及空间构象分析

目的 构建抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)重链可变区 (VH)单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因 ,并进行空间构象分析。方法 选用人IgG3上游铰链区作为抗体和人p5 3四价功能域之间连接的linker。利用回归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p5 3四价功能域融合基因 ,并在融合基因 5’端和 3’端引入SalⅠ与HindⅢ酶切位点 ,将融合基因克隆入 pUC1 9载体中构建pUC1 9/IgG3 /p5 3克隆载体。将抗人γ SmVH 单域抗体克隆入 pUC1 9/IgG3 /p5 3载体中 ,构建抗人γ SmVH 单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因。经酶切鉴定及序列测定证实后 ,利用计算机软件进行空间构象分析。结果 获得了抗人γ SmVH 单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因 ,基因全长 5 2 8bp ,可编码 1 76个氨基酸 ,与已发表的抗人γ SmVH 单域抗体、人IgG3上游铰链区和人p5 3四价功能域基因cDNA序列一致。计算机软件分析结果显示 ,融合基因表达产物可自动装配成四聚体抗体 ,并具有四条长的、柔性好的多肽 ,可确保每个抗体空间构象的独立性。结论 构建成功四价抗人γ SmVH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。

人γ-精浆蛋白的亲和纯化及其糖基化分析

目的:从人精液中提纯γ-精浆蛋白并对其生物学特性进行鉴定。方法:应用饱和硫酸铵法从小鼠腹水中纯化出抗γ-精浆蛋白的单克隆抗体E4B7,将其共价交联到CNBr-Sepharose4B上,制备成免疫亲和层析柱,用该层析柱亲和纯化经饱和硫酸铵粗提的精液标本。纯化产物分别用SDS-PAGE、Western-blot及ELISA进行生物学特性鉴定,最后经PNGaseF、Endo-H酶消化后进行糖基化分析。结果:SDS-PAGE电泳表明纯化蛋白的相对分子量约为44kDa,Western-blot及ELISA鉴定显示该蛋白可与抗γ-精浆蛋白的单抗E4B7特异性结合。对纯化蛋白无论是单用Endo-H酶消化,还是同时用Endo-H酶和PNGaseF酶共同消化,消化产物电泳后相对分子量均降低到34kDa左右,而单独用PNGaseF酶消化后相对分子量没有改变。Western-blot及ELISA鉴定显示糖苷酶处理后的纯化蛋白仍可与单抗E4B7特异性结合。结论:成功纯化出N-糖基化形式的γ-精浆蛋白,这为下一步筛选人源化抗体奠定了纯的抗原基础。

绵羊精浆蛋白质组2-DE图谱的构建及初步分析

本研究比较了丙酮沉淀法制备蛋白质不同上样量对绵羊精浆蛋白质二维电泳图谱的影响。结果显示,精浆总蛋白经SDS-PAGE电泳,得到分子质量在14.4~116 ku的28条蛋白质条带。二维电泳图经PDQuest 8.0分析,上样量为0.8、1.0、1.2 mg时检测出的蛋白质点分别为207±10、281±13和374±16个,分子质量基本分布在20~80 ku、等电点为4~9的区域内,随着上样量的增加,分子质量在20~80 ku的蛋白质点明显增多,但每个分子质量区间的蛋白质点所占的比率较为恒定。研究结果表明,采丙酮沉淀制备精浆蛋白结合合适的上样量能够建立绵羊精浆全蛋白质图谱,为进一步研究绵羊精浆蛋白质组学奠定基础。

哺乳动物精浆蛋白与精子成熟关系的研究进展

本文对哺乳动物精浆蛋白与精子成熟的相关性作了较为详细的阐述。其中与精子运动相关蛋白有精浆精子活动抑制剂(SPMI),精液凝胶素-Ⅰ和Ⅱ(Sg-Ⅰ和Sg-Ⅱ),子宫珠蛋白(UG),转谷氨酰胺酶(TG),转铁蛋白,分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI),α 2-巨球蛋白(α 2-M),前列腺特异性抗原(PSA),高分子量Zn结合蛋白(HMW),前列腺体等。与精子形态、获能、顶体反应及受精相关有胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ),BSP家族,caltrins,胰蛋白酶抑制剂(P12),抗凝集素样唾液酸蛋白,cathelicidin(hCAP-18),GP-83,新型纤维粘连蛋白Ⅱ型(Fn2),岩藻糖结合蛋白,金属蛋白酶-2(TIMP-2)等。对精浆中与精子成熟相关蛋白的研究在生殖和避孕方面都具有十分重要的现实意义。

抗前列腺癌γ-精浆蛋白人源Fab抗体的原核表达和特性鉴定

目的:对从噬菌体抗体库筛选的抗γ-精浆蛋白(γ-sm)人源化Fab抗体进行表达纯化和生物学特性鉴定,为其应用于前列腺癌抗体导向酶—前药治疗奠定基础。方法:首先将重组表达载体γ-sm-hFab/pComb3X转化大肠杆菌并诱导其可溶性表达,亲和纯化后采取Western-blot检测表达产物对γ-sm抗原结合特异性。其次分别采用抑制ELISA和竞争抑制ELISA方法分析表达纯化的抗γ-sm人源Fab抗体的亲和力和结合表位。最后采用竞争抑制流式细胞术和免疫组化超敏S-P法鉴定制备纯化的人源Fab抗体在前列腺癌细胞和组织上的结合分布特性。结果:成功诱导表达和纯化出理论分子量大小可溶性Fab抗体蛋白,含量约占细菌总可溶性蛋白的20.5%,Western-blot证实其能特异性结合识别γ-sm。抑制ELISA显示其表观结合常数(Ka)为0.78×10~8M^(-1),亲和力约为亲本鼠源单抗E4B7的37.5%,竞争抑制ELISA进一步显示,二者识别γ-Sm抗原蛋白上的表位相同。流式细胞术和免疫组化显示,表达纯化的人源Fab抗体可显著地与前列腺癌细胞和组织特异性结合,其结合主要分布在腺上皮内瘤和中低度恶性的前列腺癌组织上。结论:成功地对筛选的抗γ-sm人源Fab抗体进行了原核可溶性表达、纯化和免疫生物学特性鉴定,为其进一步应用于抗体导向酶—前药实验治疗前列腺癌奠定了基础。

高效毛细管电泳检测人精浆蛋白

用贝克曼公司的Ｐ／ＡＣＥ５０００型毛细管电泳仪成功分离人精浆蛋白组份２０余种，分析２０例正常精浆和１３例无精子精浆蛋白。结果：有４种蛋白组分差异显著（Ｐ＜０．０５）或差异非常显著（Ｐ≤０．０１），将毛细管电泳与醋纤膜电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳比较，前者具有高分辨率、快速、自动化程度高、样品用量少等特点。对无精子精液精浆蛋白分析，毛细管电泳提供了新的诊断技术。

人精浆中γ－精浆蛋白的分离纯化研究

通过离心，透析分离正常人精浆，再经二次ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤层析，成功的纯化了γ－精浆蛋白。等电聚焦电冰法测其等电点约为ｐＩ６．５，凝胶过滤层析法测其分子量约为２８０００。免疫电泳结果证明其纯度较高，并与人血清、唾液、初乳等无交叉抗原。在法医物征实践及临床诊断方面均具有重要意义。

人精浆蛋白在前列腺癌中的免疫组化研究

对2例前列腺结节状增生,21例前列腺癌石蜡切片,用我院中心实验室研制的兔抗人γ-SM血清进行双PAP染色,以观察γ-SM的存在与分布。结果结节状增生皆阳性,前列腺癌的阳性率为85.7%(18/21例)。

人精浆蛋白放射免疫分析法及其临床应用

作者报道从人精液中提纯精浆蛋白(γ—Sm),建立了γ—Sm放射免疫分析法。平均回收率为102.6％,最低检出量为0.1μg/L批内、批间变异系数分别为3.3％和4.5％.140例正常男性血清中γ—Sm含量为0.83±0.71μg/L,50例正常女性血清γ-Sm含量均在0.1μg/L以下,26例前列腺癌的均值为205.4μg/L,阳性率23/36(88.5％).

γ-精浆蛋白:前列腺特异性抗原

二十多年前,基于法医学上的需要,日本久留米大学医学院的法医系开始对精浆中蛋白质进行研究,他们用血清学的方法分离了几种蛋白质,命名为α2—精浆糖蛋白（α2—SGP）,β-精浆蛋白（β-Sm）,β-微精浆蛋白（β-MSP）,γ-精浆蛋白（γ-Sm）及精浆铁蛋白（Sf）等。后来,α2—SGP、β-Sm 和Sf 被证明是由精囊分泌的,而γ-Sm 和β-MSP则是来源于前列腺。最近,通过对氨基酸成份和序列的分析,证明γ-Sm 与1979年Wang 等命名的前列腺特异性抗原（PSA）以及1978年Sensabaugh

特发性弱精子症精浆蛋白差异表达研究

目的探讨精浆蛋白在成年男性特发性弱精子症中的差异表达情况。方法纳入2017年1-5月我院泌尿外科门诊特发性弱精子症患者15例作为试验组,年龄24~47岁。同时,纳入精液正常成年男性15例作为对照组,年龄21~44岁。用等重同位素多标签相对定量蛋白质组学(isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)的方法研究成年男性正常精浆蛋白以及特发性弱精子症患者的精浆蛋白表达情况。结果共发现精浆中2 784个蛋白质。其中,与正常组相比,特发性弱精子症患者精浆中表达上调蛋白数为14个,精浆中表达下调蛋白数为79个(表达差异倍数>1.2倍,且P<0.05)。经斑点印迹技术验证蛋白INF2表达水平与iTRAQ结果一致。经GO(gene ontology)蛋白功能注释及富集分析,特发性弱精子症精浆中差异蛋白功能主要包括调节钙离子跨膜转运、胞浆内转运以及螯合、蝶呤钼辅因子合成及代谢、调节铜离子跨膜转运等。经KEGG蛋白通路注释及富集分析,特发性弱精子症精浆中差异蛋白主要富集于叶酸生物合成、金黄色葡萄球菌感染等通路。结论特发性弱精子症患者精浆蛋白同正常成年男性精浆蛋白存在差异,其可能是引起特发性弱精子症的原因。

γ—精浆蛋白的测定对前列腺癌的诊断意义

γ—精浆蛋白(γ-Seminoprotein,γ-Sm)是精液中与前列腺相关的一种特异性糖蛋白,电泳时位于γ区带,分子量为23000左右.早年用于法医鉴定,近年来用抗γ-Sm 抗体作免疫组化染色,发现它定位于前列腺上皮细胞.前列腺癌时。

十一酸睾酮对人精浆蛋白的影响

本文采用SDS—PAGE法,测定7例健康育龄男子在肌肉注射十一酸睾酮(TU)前,用药后l、2、3个月及停药后精子计数恢复正常时的精浆蛋白浓度和组份变化,并结合血清测定激素水平及常规精液分析,以探讨TU对上述指标的影响及其相互关系。结果显示:用药早期精浆总蛋白浓度开始逐步降低,在停药后精子计数恢复正常时仍未达到正常水平。精浆总蛋白浓度的变化与精子活动率、前向运动率及LH呈正相关(r值分别为0.8975、0.7776、0.6406,P<0.01或0.05)。精浆蛋白组份也发生变化,其中51KD、37KD的蛋白条带变化最为明显,其变化除与精子活动率相关外(r=0.9094,P<0.01),其中51KD蛋白条带的变化还与精子前向运动率相关(r=0.7660,P<0.05)。上述结果提示TU可能在抑制生精之前即通过改变精浆蛋白而影响精子的功能,说明单用睾酮(T)的避孕机理是多因素的。

电泳分析精浆蛋白质

目的:探讨精浆蛋白质特性以及对男性不育症的影响。研究其作为男性不育症蛋白质诊断指标的科学性、可行性和实用性。方法:利用自动化琼脂糖区带电泳对精浆蛋白质进行分离。结果:碱性琼脂糖凝胶电泳可将精浆蛋白质分为6个组分,分别命名为A带、B带、C带、D带、E带、F带。弱精组C带低于正常组,E带高于正常组,弱畸精组B带低于正常组。结论:由于弱精组C带低于正常组、E带高于正常组,弱畸精组B带低于正常组。推测弱精的原因除免疫因素外,还可能与其它未知因素有关。与弱精和弱畸精相关的蛋白质可能位于C带、E带和B带中。也就是这些蛋白电泳时位于γ区和靠近α2区,主要是一些球蛋白。至于具体哪些蛋白在其中起作用以及作用大小,尚需进一步探讨。