一个新的水稻亚精胺合成酶基因克隆、表达及特性分析(英文)

在亚精胺生物合成中,亚精胺合成酶负责从S-腺苷甲硫氨酸到腐胺过程中催化转移丙胺,其在生物生长发育中发挥重要作用。本研究利用3末端cDNA快速扩增技术从水稻中获得一个新的亚精胺合成酶基因,命名为OsSPDS3。OsSPDS3包含一个1 194 bp的开放阅读框,该阅读框编码397个氨基酸。结构域预测结果表明亚精胺合成酶含有一个完整的精胺合成酶结构域,2个推测的低复杂性区段和多个S-腺苷甲硫氨酸结合位点。三维结构预测显示OsSPDS3含有α螺旋,β折叠和卷曲结构。进化分析表明OsSPDS3属于植物类亚精胺合成酶基因家族,与拟南芥亚精胺合成酶3和水稻亚精胺合成酶2划分为一个亚类。盐处理能显著上调OsSPDS3表达,但水稻亚精胺合成酶1和2对盐处理没有响应。此外,干旱和低温处理都不能改变3个水稻亚精胺合成酶基因表达,以上结果暗示OsSPDS3可能在水稻盐反应中发挥独特作用。

地塞米松对大鼠再生肝细胞亚精胺合成酶基因转录的影响

采用原位杂交技术研究地塞米松对大鼠再生肝细胞亚精胺合成酶(spermidine syathase,SPDS)基因表达的影响。结果显示,部分肝切除(partial hepatectomy,PH)后,再生肝细胞mRNA表达量呈现先升高后降低的变化趋势,峰值均出现在PH后9h。PH+去肾上腺使mRNA水平升高,主要表现在PH后6～12h;地塞米松处理组SPDS基因表达量明显下降,并且随着地塞米松剂量升高,mRNA表达水平降低。结果表明,地塞米松对早期再生肝细胞SPDS基因表达具有抑制作用。

刺五加亚精胺合成酶基因的克隆及内生真菌对其表达的影响

目的克隆刺五加亚精胺合成酶(spermidine synthase,SPDS)基因,并分析内生真菌对其表达的影响。方法采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加SPDS基因全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析。RT-PCR法检测内生真菌菌株P116-1a、P116-1b、P109-4和P312-1对SPDS基因表达的影响。结果刺五加SPDS基因的cDNA全长为1 541 bp,开放阅读框长1 002 bp,编码333个氨基酸的蛋白,包含SPDS家族的基本结构和标志性序列。RT-PCR结果显示,内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达量(P<0.05),最大表达量出现在菌株P116-1b回接90 d时,是对照的2.06倍。结论首次克隆了刺五加SPDS基因的cDNA全长序列,并证实内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达,为阐明内生真菌提高刺五加三萜皂苷量的机制及刺五加的抗逆性改良奠定了基础。

精胺合成酶MrSPS参与调控罗伯茨绿僵菌的生长发育、抗逆和致病力

本研究以罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii为研究对象,针对鉴定出的精胺合成酶基因(MAA_02088,Mrsps),利用农杆菌介导的同源重组方法获得Mrsps敲除株ΔMrsps。与野生型相比,ΔMrsps营养生长和产孢能力下降,对氯化钠和紫外照射耐受性增强。大蜡螟幼虫毒力分析表明,浸渍和注射两种情况下ΔMrsps致病力降低,半致死时间(LT50:6.71和4.75 d)比野生型(LT50:5.17和4.19 d)显著增加。Mrsps敲除后不影响附着胞形成率和蝉翅穿透能力,但会显著下调昆虫血腔定殖相关基因的表达量。这些结果说明精胺合成酶Mr SPS参与调控罗伯茨绿僵菌的生长发育、外界胁迫应答和致病力。

转录组分析罗伯茨绿僵菌精胺合成酶MrSPS介导真菌血腔定殖功能

【背景】精胺在植物应对逆境胁迫、动物抵抗疲劳和衰老、真菌生长代谢等过程中发挥重要作用,但目前在昆虫病原真菌中的研究未见报道。【目的】在分子水平上探究罗伯茨绿僵菌精胺合成关键酶——精胺合成酶在昆虫血腔定殖中的作用机制。【方法】显微注射法测定Mrsps敲除株ΔMrsps的致病力变化,并观察血腔中ΔMrsps生长状态;收集ΔMrsps和野生型WT注射侵染30 h后的大蜡螟血淋巴进行转录组测序,分别与罗伯茨绿僵菌和大蜡螟参考基因组进行比对分析,并结合定量PCR进行验证。【结果】与WT和回补株ΔMrsps-cp相比较,ΔMrsps致病力显著下降,而且随着注射浓度的降低,ΔMrsps致病力下降越显著。侵染36 h后WT和ΔMrsps孢子都能正常萌发且开始以类酵母状态生长,60 h后,相较于WT,ΔMrsps的生长繁殖数量较少。转录组共检测到3202个罗伯茨绿僵菌基因,其中1769个基因在ΔMrsps中表达上调,922个基因表达下调;差异表达基因涉及碳水化合物代谢、运输、分解代谢、翻译和氨基酸代谢等多条途径;筛选出28个血腔致病相关基因全部在ΔMrsps中表达下调;定量PCR检测发现在整个血腔定殖阶段免疫逃避蛋白Mcl1基因和血腔定殖Colonization of hemocoel 1基因在WT和ΔMrsps-cp中的表达量高于ΔMrsps。共检测到13249个大蜡螟基因,其中4026个差异表达基因;KEGG注释分析显示大量差异表达基因富集到内分泌系统和免疫系统等途径;深入分析发现22个差异表达基因归属于Toll和Imd信号通路,其中18个基因在ΔMrsps侵染的大蜡螟中表达上调,表明ΔMrsps侵染大蜡螟过程中更易引起免疫系统的激活。【结论】揭示了Mrsps在罗伯茨绿僵菌血腔定殖阶段作用的分子机制,为进一步揭示精胺在真菌中的作用机理提供了理论基础。

解淀粉芽胞杆菌中speE基因在亚精胺合成中的功能鉴定

亚精胺(spermidine)具有抗衰老、提高记忆力、诱导细胞自噬等多种生物活性,但生物合成量偏低,挖掘亚精胺合成相关基因资源对其代谢工程育种至关重要。在解淀粉芽胞杆菌中,已预测含有亚精胺合成酶基因(spe E),然而其在亚精胺形成中的功能尚未得到鉴定。为证实spe E基因的功能,研究构建了spe E基因缺失菌株和回补表达菌株,探究了该基因对亚精胺合成的影响。结果表明,敲除spe E基因未检测到亚精胺,菌株丧失亚精胺合成能力;回补spe E基因后,亚精胺合成能力恢复。该研究首次证实了spe E基因在解淀粉芽胞杆菌合成亚精胺中的功能,为亚精胺的代谢工程育种及相关研究奠定了基础。

申克孢子丝菌SPDS基因的生物信息学分析及分子克隆

[目的]分析预测申克孢子丝菌cDNA中编号为Locus_ 168_Contig_1序列编码的基因及蛋白质结构、功能特征,并进行分子克隆.[方法]利用NCBI及Expasy网站提供的BLASTx、SignalIP、InterPro Scan等生物信息学软件分析其序列,判断其是否为全长编码序列、同源序列名称,并分析其结构、定位及功能等;将其中的全长编码区利用PCR方法进行扩增后克隆到pET-30a（＋）载体,测序验证.[结果]该序列是亚精胺合成酶（SPDS）的同源基因,全长序列为1062 bp,包含完整的编码区190 ～1 062 bp,编码291个氨基酸,在GenBank中,其与粗糙脉孢菌的SPDS基因同源性最高,达88％.理化性质预测其编码蛋白疏水性高;无质体、线粒体等定位序列,不存在跨膜螺旋结构,为非分泌型蛋白.进化树分析结果显示与粗糙脉孢菌同源性最高;PCR扩增及测序结果证实目的基因成功克隆进入pET-30a（＋）质粒.[结论]获得申克孢子丝菌SPDS的基因及蛋白结构、功能特点,构建了其重组表达质粒,将为进一步明确其在孢子丝菌病中的致病作用奠定理论基础.

钝齿棒杆菌的代谢改造:L-鸟氨酸与L-瓜氨酸合成菌株的构建

【目的】对一株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5进行代谢工程改造,构建L-鸟氨酸和L-瓜氨酸合成菌株,并考察其发酵生产相应氨基酸的性能。【方法】分别敲除菌株SYPA5-5鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase,OTC)的编码基因argF和精胺琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase,ASS)的编码基因argG,构建能够合成L-鸟氨酸及L-瓜氨酸的重组菌株SYPA5-5△argF和SYPA5-5△argG;考察不同营养条件对上述重组菌株生长和相应氨基酸积累的影响。【结果】添加0.3 g/L L-精氨酸可满足SYPA5-5△argF的生长及L-鸟氨酸积累所需,L-鸟氨酸产量可达21.5 g/L;添加L-精氨酸有利于SYPA5-5△argG的生长,但不利于L-瓜氨酸的积累;不添加L-精氨酸时,L-瓜氨酸产量可达15.2 g/L,同时积累6.8 g/L的L-谷氨酸。【结论】分别敲除L-精氨酸生产菌株SYPA5-5的argF及argG基因,可实现L-精氨酸合成途径的中间代谢物L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的积累,拓展了该菌株的工业应用范围。

转录组学分析鹅等级前卵泡中多胺代谢关键酶的差异表达

为了解多胺代谢关键酶亚精胺合成酶(spermidine synthase,SRM)、精胺合成酶(spermine synthas,SMS)和精胺氧化酶(spermine oxidase,SMOX)在鹅等级前卵泡中的表达情况,本研究基于高通量测序技术对鹅等级前卵泡进行转录组测序分析,并通过荧光定量PCR对结果进行验证。通过FPKM值计算分析,这3个基因在鹅等级前卵泡中均有表达,且随着卵泡的发育,SRM和SMS的表达呈现先降低后增加再降低的趋势,在初级卵泡中的表达量达到最高值,在中白卵泡中的表达量最低;SMOX的表达则呈现先增加后降低的趋势,初级卵泡中的表达量最低,中白卵泡中的表达量最高。荧光定量PCR结果与转录组测序结果基本相同。结果证实SRM和SMS对卵泡的发育有促进作用,而SMOX可能参与卵泡闭锁过程。

SMS、SRM和SMOX基因mRNA在鹅等级前卵泡中的表达

为研究精胺、亚精胺和腐胺对鹅等级前卵泡发育的作用,通过荧光定量PCR对其合成代谢关键酶亚精胺合成酶(spermidine synthase,SRM),精胺合成酶(spermine synthas,SMS)和精胺氧化酶(spermine oxidase,SMOX)基因mRNA在鹅等级前卵泡中的表达情况进行检测分析。结果发现:SMS,SRM和SMOX基因mRNA在鹅等级前卵泡中均有表达,通过差异分析发现SMS基因mRNA在PE等级卵泡中的表达量最高,且表达量显著高于其他4个等级卵泡(P<0.05);而在SY,L,M和S这4个等级卵泡中表达量差异不显著(P>0.05)。SRM基因mRNA在PE和L等级卵泡中的表达量较高,差异不显著(P>0.05),但显著高于其他3个等级卵泡(P<0.05);而在SY,M和S等级卵泡中SRM基因mRNA的表达量差异不显著(P>0.05)。SMOX基因mRNA在5个等级卵泡中表达差异显著(P<0.05)。

植物多胺代谢途径研究进展

多胺是一类小分子生物活性物质,广泛存在于生物体内,与植物的生长发育、衰老及抗逆性都有着密切的联系。目前,在植物中的多胺合成途径已经基本揭示,其生理作用在分子水平上逐步得到阐明。对多胺合成突变体和各种转基因植物的研究也使得人们更深入地了解了多胺以及其合成代谢相关酶在植物生长发育等生理过程中的重要作用。以下概述了植物多胺代谢途径,重点综述了代谢途径中各基因的功能及遗传操作的最新进展,并对将来的研究方向尤其是相关基因在植物抗逆境(包括生物和非生物逆境)基因工程方面的应用作了讨论。

农杆菌介导酸枣叶片遗传转化SPDS基因体系的建立

为研究根癌农杆菌介导的SPDS基因遗传转化酸枣叶片体系建立的条件,本研究以酸枣叶片为受体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens, LBA4404)介导法,将SPDS基因导入酸枣基因组,并对其遗传转化体系进行优化,对筛选获得的转基因酸枣植株进行检测。结果表明,根癌农杆菌介导的SPDS基因遗传转化的最佳条件为:将预培养3 d的酸枣叶片,用LBA4404菌株菌液(OD600=0.6)浸染15 min,共培养3 d,然后转入含Kan 20 mg/L和Cef 200 mg/L的筛选分化培养基上诱导分化,待抗性芽长到2～3 cm后,转入含Kan 40 mg/L和Cef 100 mg/L的筛选生根培养基上进行筛选,在以上最佳遗传转化条件下,经过3次筛选得到19个抗性植株,经PCR检测,有9株呈阳性,即SPDS基因已被整合到酸枣基因组中,并可以正常转录。本研究成功建立了根癌农杆菌介导的酸枣叶片高效遗传转化体系,为枣树基因工程育种和种质创新提供了帮助。