糖化酵母糖化酶基因在酿酒酵母中的克隆与表达

糖化酵母结构基因ＳＴＡ编码分泌到胞外的葡萄糖淀粉酶（α－１，４－葡聚糖－葡糖水解酶，ＥＣ３．２．１．３），俗称糖化酶。通过限制性内切酶Ｓａｕ３Ａ部分酶切糖化酵母染色体，以穿梭质粒ＹＥＰ１３作载体，建立糖化酵母的基因文库，转化ｓｔａ°ｉｎｈ°型酿酒酵母受体菌Ｃ＿２，筛选出三株ｓｔａ￣＋转化子，检测出５．３ｋｂ大小的外源基因片段，继而采用薄层层析、ＫＮＲ染料测酶活性等方法对外源基因产物进行了鉴定并测定了酶活最佳反应条件。

黑曲霉糖化酶基因在荧光假单胞菌中的表达

黑曲霉糖化酶基因cDNA按正确的读码框架克隆到广宿主表达载体pBBR1MCS-2,构建出含黑曲霉糖化酶基因的表达载体pBBR1MCS-2GA,用三亲和接合转化法将重组质粒导入2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株荧光假单胞菌AR4。得到重组菌ARW4,经SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot分析显示,黑曲霉糖化酶基因在ARW4中得到表达,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在。

黑曲霉糖化酶基因启动子功能鉴定

从糖化酶工业生产菌株Aspergillus nigerCICIM F0410基因组DNA中扩增糖化酶基因启动子(PglaA),并将该启动子替换质粒pRS303K上KmR基因启动子,构建成糖化酶基因启动子功能检测质粒pRS-PglaA-KmR。将pRS-PglaA-KmR转入E.coliJM109中,得到重组菌E.coli(pRS-PglaA-KmR)。通过对重组菌的氨基糖苷磷酸转移酶基因活性检测,表明PglaA在E.coli中具有驱动KmR基因表达的活性。采用不同诱导物进行培养发现,葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖或玉米淀粉,可以不同程度增强PglaA的强度。

产糖化酶酵母在木薯燃料乙醇生产中的应用研究

通过现代生物技术构建的产糖化酶酵母,在酒精生产过程中既能够高效产酒、又能够替代部分糖化酶。具有降低发酵体系中还原糖,稳定发酵酒份,抑制挥发酸,减少安菌泰的使用等优势,同时一定程度下,降低了酒精废水的COD值,减轻了环保压力。若我司按照糖化酶替代量50%计算,则年节约成本242万元。

原生质体融合和秋水仙素染色体加倍构建强发酵淀粉的糖化酵母研究

通过原生质体融合或秋水仙素染色体加倍技术 ,构建成交配型位点基因纯合 (α/α)的二倍体 .对所获二倍体及其亲株的糖化酶酶活性进行测定 .结果表明 ,这 3个非连锁的糖化酶等效异位基因表现出显著的剂量效应 ,应用中 3株纯合二倍体CIY187 14 (STA3/STA3) ,SFY5 5 (STA2 /STA2 )和CI12C 6 6 (STA1/STA1)菌株 ,其酶活性分别是其亲株的 2 4 4 ,2 31和 2 31倍 。

固定化“双功能”酵母基因工程菌在酒精工业生产中的应用

应用基因克隆技术将黑曲霉产糖化酶基因cDNA转入经优化的受体菌(酿酒酵母京龙JL108号),获得多株具有产糖化酶能力的酿酒酵母,再经反复筛分、驯化获得JL1(YIp128D.17N),采用变性PVA固定化增殖活细胞包埋技术,将JL1制成具有糖化酒化“双功能”的固定化酵母,大幅度提高细胞数,增强了大生产基因工程菌的糖化、酒化能力,载体产酶能力在10u/g·h以上,酒精发酵醪液中酶活达20u/ml以上,在年产5000t的富川县酒精厂进行工业性生产应用试验,技术指标完全达到并超过传统工艺的生产水平,淀粉出酒率达55%以上。

利用淀粉的酿酒酵母基因工程菌研究进展

酿酒酵母是发酵工业的重要微生物,主要用于酒精、啤酒和面包工业。在酿酒酵母中已表达的淀粉酶基因包括α-淀粉酶基因和糖化酶基因。外源淀粉水解酶能在酵母中高效表达并分泌,其主要因素在于:在构建载体时组入强启动子;酿酒酵母中带有合适的酵母受体系统;具有外源淀粉酶蛋白的分泌信号;外源淀粉酶基因的遗传稳定性和生长介质。构建分解淀粉酿酒酵母已取得相当大的进展,但在构建的多数菌株利用糊精及淀粉的能力仍然有限,而且降解速率较慢。构建直接分解和利用淀粉的酵母工程菌,可简化工艺、节省能源和酶制剂、降低成本,有重要的应用前景。(孙悟)

黑曲霉T21 glaA 5’上游调控区的两个蛋白结合因子及其靶序列

采用凝胶阻滞法从糖化酶高产株黑曲霉(Aspergillus niger)T21部分纯化的蛋白提取液中检测到与糖化酶基因(glaA)5＇cis调控区特异结合的两个蛋白因子,其一的靶DNA定位在glaA翻译起始点(ATG)上游-580～-509及-318～-254bp两个区域,另一蛋白因子的靶DNA定位在-809～-580区域.-580～-509序列含有“TATA”的重复结构,-318～-254序列富含“GC”以及-809～-580序列含有CCAAT的特点暗示此3片段及其所结合的蛋白因子在A.niger T21 glaA的表达调控中可能有重要作用.

黑曲霉T21 glaA 5'上游调控区DNA与蛋白因子的相互作用分析

以糖化酶生产菌株黑曲霉T21（Aspergillus niger T21）的糖化酶基因（glaa）5＇cis调控区片段为探针,采用电泳迁移率变动分析（EMSA）法,从黑曲霉蛋白粗提液中检测到与glaA 5＇调控区特异结合的蛋白因子,并把其结合DNA定位在T21 glaA 5＇调控区的-374～-344,-484～-414以及-580～-540 bp 3个区段,且此3个结合DNA的片段在EMSA实验中呈现交叉竞争,表明这3个DNA区段可与同一个蛋白因子相结合.以-374～344 bp序列为探针的紫外交联实验表明,该蛋白因子的分子量（或亚基分子量）约为10ku.利用DNase I足印分析确定了此蛋白因子在前两个区段的精细结合部位,并对其结合序列的特性进行了分析.