猪生长激素基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及产物的N-糖基化分析

利用含有强启动子PAOX 1 和α MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体质粒pPICZαA构建出含PST基因的重组质粒pPICZαA pST。通过电击将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST质粒转化到巴斯德毕赤酵母X 33菌中 ,并筛选Mut+ 表型的重组菌。表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,分泌于胞外的PST蛋白分子量比天然PST分子量稍大 ,而胞内的PST蛋白分子量与天然PST大小相同。将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST再次转化重组酵母细胞X 33 pPICZαA pST(Mut+ ) ,所得表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果显示 ,PST基因的表达水平明显提高 ,且表达产生的蛋白均可发生正确的抗原 抗体结合反应 ,表达量达 95 6mg L。将发酵液上清进行N 糖基化分析 ,显示rPST无N

人血清Alpha-1-酸性糖蛋白的糖基化分析

获取真实准确的蛋白质糖基化信息是全面了解糖基化修饰生物学功能的前提.针对简单蛋白质的糖基化分析通常采用反相高效液相色谱-串联质谱技术在肽的水平上对糖基化信息进行采集和解析.本文以人血清Alpha-1-酸性糖蛋白(AGP)酶解液为对象,发展了一套简单有效的蛋白质糖基化分析方法.本方法分为三个步骤,第一步是建立糖肽的理论m/z值表;第二步是获取糖蛋白酶解液的LC-MS谱图,并将每一个色谱峰中所包含糖肽的实际m/z值与理论m/z值进行人工匹配;第三步是对每个色谱峰的糖肽结构归属进行LC-MS/MS验证.采用本方法,我们从AGP酶解液中共鉴定出172条糖肽.与单独采用Survey模式的方法相比,本方法能够显著提高糖肽的覆盖率.

治疗类糖蛋白的糖基化分析

糖基化作为至关重要的一种蛋白质翻译后修饰,在治疗类糖蛋白的安全性、有效性、质量可控性中起到关键性作用。然而,糖基化为非模板依赖性的酶促修饰,具有天然的异质性,使得糖基化的分析成为治疗类糖蛋白表征及质控的一个挑战。为了推动治疗类糖蛋白的技术法规建立及质控水平提高,本文从治疗类糖蛋白糖基化分析的核心理念、分析策略、良好分析的实施以及技术趋势4个方面进行深入探讨,力图为我国工业界治疗类糖蛋白糖基化分析提供参考,推动我国糖蛋白类生物医药产业的发展。

慢性丙型肝炎合并2型糖尿病患者HCV载量与糖代谢指标的相关性分析

【目的】探讨慢性丙型肝炎(CHC)合并2型糖尿病(T2DM)患者丙型肝炎病毒(HCV)载量与糖代谢指标的相关性。【方法】选取2019年3月至2021年2月本院收治的98例CHC合并T2DM患者(合并组)、76例单纯CHC患者(CHC组),另外选取在本院体检的80例健康志愿者为对照组,比较三组临床资料、糖代谢指标。将CHC合并T2DM患者依据HCV载量的不同分为病毒阴性组、低病毒载量组、中病毒载量组和高病毒载量组四个亚组,比较不同HCV载量的CHC合并T2DM患者糖代谢指标水平;采用Pearson相关性分析CHC合并T2DM患者HCV载量与糖代谢指标的关系。【结果】三组体重指数(BMI)及总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);合并组BMI及TC、LDL-C水平高于CHC组和对照组(P<0.05)。三组空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2hPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)和空腹胰岛素(FINS)水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);合并组FPG、2hPG、HbA1c和FINS水平均高于CHC组和对照组(P<0.05)。不同HCV载量CHC合并T2DM患者FPG、2hPG、HbA1c和FINS水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);低病毒载量组、中病毒载量组和高病毒载量组FPG、2hPG、HbA1c和FINS水平均高于病毒阴性组(P<0.05);高病毒载量组FPG、2hPG、HbA1c和FINS水平又均高于低病毒载量组和中病毒载量组(P<0.05)。CHC合并T2DM患者HCV载量与2hPG、FINS水平无相关性(P>0.05),与FPG、HbA1c水平均呈正相关(P<0.05)。【结论】相比单纯CHC患者和健康者,CHC合并T2DM患者糖代谢存在明显异常,且CHC合并T2DM患者HCV载量与FPG、HbA1c存在一定的相关性。

踝肱指数对糖尿病足的临床预测价值及相关因素分析

目的:了解踝肱指数(ABI)与糖尿病足发生率的关系,并探讨其相关危险因素,以便早期采取有效措施预防糖尿病足的发生。方法:438例确诊为2型糖尿病的住院患者,分为非糖尿病足组(NDF)391例及糖尿病足组(DF)47例,所有患者均进行ABI及糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)等生化资料的检测,比较两组临床生化资料及不同ABI组糖尿病足患病率的差异,并进行糖尿病足相关危险因素的logistic回归分析。结果:1两组间比较,年龄、性别、病程、HbA1C及LDL、超敏CRP、高血压及吸烟史、糖尿病肾病及视网膜病变差异显著;2ABI与糖尿病足患病率呈类似"U"型分布的关系,不同ABI组间患病率有显著性差异;3logistic回归显示:2型糖尿病年龄、病程、HbA1C、ABI及糖尿病肾病是糖尿病足病变发生的危险因素。结论:ABI与DF的发生存在明显的相关性,ABI降低或异常升高可早期预测糖尿病足的发生,对有ABI异常的高危糖尿病患者积极采取有效的干预措施意义重大。

糖尿病患者尿微量白蛋白/肌酐与血糖控制相关性分析

目的:探讨糖尿病患者血糖控制水平与尿中微量白蛋白/肌酐排泄率相关性。方法:对192例已确诊的糖尿病患者进行糖化血红蛋白和尿微量白蛋白及尿肌酐的测定,按结果分组比较。结果:HbA1c与mALB/Cr在各组间比较差异均显著性(P<0.01)。各组糖尿病中HbA1c与mALB/Cr呈正相关(r=0.812,P=0.012)。结论:有效控制血糖可以减少糖尿病肾损伤的程度,预防早期糖尿病肾病。

糖尿病100例糖化血红蛋白的检测结果分析

目的:通过对100例糖尿病患者的糖化血红蛋白检测结果进行分析,探讨该项目在糖尿病诊断及治疗中的应用及其临床价值。方法:采用免疫比浊法。结果:100例糖尿病患者的糖化血红蛋白检测结果在正常参考范围内4%～6%有20例;在6%～10%有61例;在10%以上有19例。通过统计,有19%糖尿病患者血糖控制未达到标准。结论:糖化血红蛋白可以作为糖尿病患者血糖水平监测和调整治疗方案的重要指标,具有重要的临床意义和使用价值。

INR、HbA1c、ICP与颅脑外伤患者神经缺损程度的相关性及对预后的预测价值分析

【目的】探讨国际标准化比值(INR)、糖化血红蛋白(HbA1c)、颅内压(ICP)与颅脑外伤患者神经缺损程度的相关性及对预后的预测价值。【方法】回顾性分析上海市松江区中心医院收治的85例颅脑外伤患者的临床资料,根据出院时格拉斯哥预后量表(GOS)评分分为预后不良组(n=37,GOS评分1~2分)、预后良好组(n=48,GOS评分3~5分)。比较两组基线资料及INR、HbA1c、ICP,应用Pearson分析各指标与美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分相关性,采用Cox回归分析预后的相关影响因素,采用受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积(AUC)分析各指标预测预后价值。【结果】预后不良组脑疝患者比例、NIHSS评分、INR、HbA1c、ICP高于预后良好组(P<0.05)。Pearson相关性分析显示,INR、HbA1c、ICP与NIHSS评分呈正相关(r分别为0.587、0.522、0.573,均P<0.001)。Cox回归分析显示,INR、HbA1c、ICP为影响脑出血患者预后的相关因素(P<0.05)。ROC曲线分析显示,INR、HbA1c、ICP三者联合预测预后的AUC最大。【结论】INR、HbA1c、ICP与颅脑外伤患者神经缺损程度、预后有关,三者联合预测患者预后的价值更高,可为临床提供更好的参考价值。

消渴患者之糖化血红蛋白值与骨密度的相关性分析

目的:观察消渴病人糖化血红蛋白值与骨密度的关系。方法:对203例消渴病患者进行糖化血红蛋白、空腹血糖测定和双能X射线法进行腰椎、股骨近端骨度密度测定,并对糖化血红蛋白高于8%和低于7%的消渴病患者进行平均骨密度值比较。结果:糖化血红蛋白高于8%的患者平均骨密度值明显降低(P<0.05),糖化血红蛋白低于7%的患者平均骨密度值降低不明显(P>0.05)。结论:消渴病患者在糖化血红蛋白高于8%时骨密度值明显降低,所以应严格控制消渴病患者糖化血红蛋白值,防止消渴病患者继发骨质疏松的产生。

2型糖尿病患者血清镁、糖化白蛋白与增殖性糖尿病性视网膜病变发生的相关性分析

【目的】探讨2型糖尿病(T2DM)患者血清镁和糖化白蛋白水平与增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)发生的相关性。【方法】选择2017年10月至2018年12月本院诊治的T2DM患者90例,根据是否发生PDR分为PDR组(42例)和非增殖性糖尿病性视网膜病变(NPDR)组(48例)。采用免疫透射比浊法检测两组患者血清糖化白蛋白水平,采用酶联免疫吸附法检测血清镁水平,并采用受试者工作曲线(ROC)分析血清镁和糖化白蛋白对T2DM伴PDR的诊断效能,用Logistic回归分析影响T2DM伴PDR发生的危险因素。【结果】与NPDR组相比,PDR组血清镁水平较低(P<0.05),糖化白蛋白水平较高(P<0.05)。ROC曲线显示:血清镁、糖化白蛋白诊断T2DM伴PDR的曲线下面积(AUC)分别为0.699、0.768,截断值分别为0.79 mmol/L、16.35%;两者联合诊断的AUC为0.857,明显高于血清镁和糖化白蛋白的单独诊断(P<0.05),敏感度及特异度分别为71.4%、87.5%。血清镁、糖化白蛋白、甘油三酯(TG)、病程是影响T2DM伴PDR发生的危险因素(P<0.05)。【结论】T2DM伴PDR患者血清镁明显降低,糖化白蛋白则异常升高,且二者是影响T2DM伴PDR发生的危险因素,可作为诊断T2DM伴PDR的潜在指标。

外源前列腺特异性膜抗原纯化及位点特异性N-糖基化修饰谱分析

目的构建前列腺特异性膜抗原(PSMA)真核表达重组载体pcDNA3-FOLH1,293细胞系中过表达PSMA蛋白,纯化外源过表达PSMA蛋白,分析其位点特异性N-糖基化修饰谱。方法聚合酶链式反应(PCR)扩增叶酸水解酶1(FOLH1)全长基因,利用重组技术将FOLH1基因连接到真核表达载体pcDNA3;双酶切鉴定及测序无误后,利用转染技术将真核表达载体转染进293细胞系,肽-N-糖苷酶F(PNGase F)酶切鉴定PSMA蛋白;免疫沉淀技术纯化293细胞系外源过表达PSMA蛋白,质谱分析位点特异性N-糖基化修饰谱。结果成功构建PSMA蛋白真核表达重组载体pcDNA3-FOLH1;293细胞系中外源过表达PSMA蛋白,PNGase F未处理PSMA蛋白相对分子质量为100×10^(3),酶切处理之后其相对分子质量约为85×10^(3),符合预期。免疫纯化获得外源过表达PSMA蛋白之后,LC-MS揭示重组PSMA蛋白中的大多数N-糖基化修饰位点都有寡糖链占位,且高甘露糖型、杂合型及复合型组成有一定差异。结论成功完成PSMA蛋白真核表达载体的构建、表达、纯化及位点特异性N-糖基化修饰谱分析,为后续靶向PSMA的肿瘤治疗提供基础科研数据。

猪生长激素基因在昆虫细胞中的分泌表达

将PCR扩增得到的 pGH基因插入到带有 polh启动子和 gp6 7强信号肽序列的杆状病毒转移载体pAcGP6 7 A中 ,构建重组质粒 pGP6 7pGH ,并与线性化致死缺失型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 (AcMNPV OCC-)基因组DNA共转染Sf9细胞 ,构建出重组病毒AcMNPV pGP6 7 pGH OCC-。感染重组病毒的Hi5细胞的表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,细胞可溶蛋白和培养液上清中均有一条分子量约为 2 2kDa的猪生长激素特异性反应带 ,且培养液上清中的目的蛋白分子量比天然pGH略大一些。薄层扫描仪扫描估测可知 ,重组pGH分别占细胞可溶蛋白的 8 98%和培养液上清总蛋白的 3 6 1%。将表达 96h的培养液上清浓缩液进行N 糖基化分析 ,结果显示重组 pGH无N 糖基化加工修饰。

猪瘟病毒Erns蛋白在杆状病毒表达系统中的分泌表达及活性检测

为制备用于ELISA检测猪瘟病毒的E^rns蛋白,根据昆虫细胞密码子偏好性对E^rns的基因序列进行优化,将优化后的E^rns基因插入带有信号肽的表达载体pFastBacl-gp67中;随后将重组质粒pFastBacl-gp67-E^rns转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选,挑选白斑,提取重组黏粒Bacmid-E^rns;将重组黏粒转染sf21细胞得到杆状病毒,经扩增后得到P 3病毒,利用其大量感染细胞,3 d后收取细胞培养上清;通过镍填料纯化得到分泌表达的E^rns蛋白,通过SDS-PAGE及Western blot检测分泌蛋白的表达水平、纯化情况,用PNGase F处理分析其糖基化水平,通过ELISA分析其抗原性。结果显示,成功构建了重组质粒pFastBacl-gp67-E^rns,蓝白斑筛选获得了重组黏粒Bacmid-E^rns,在此基础上获得了重组杆状病毒,利用其感染sf21细胞,成功分泌表达了E^rns蛋白,纯化所得E^rns蛋白纯度较高,具有较高糖基化修饰水平,且纯化所得E^rns蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清,其抗原性良好。

2型糖尿病患者甲状腺激素水平及其与糖脂代谢相关性研究

目的:探讨2型糖尿病患者甲状腺激素水平及甲状腺功能与血糖、血脂代谢的相关性。方法:收集2型糖尿病患者426例,空腹采肘静脉血,检测糖化血红蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、促甲状腺激素(TSH)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、三碘甲状腺原氨酸(TT3)、游离甲状腺素(FT4)、甲状腺激素(TT4),分析甲状腺激素水平及甲状腺功能与血糖、血脂代谢的相关性。结果:所研究对象中促甲状腺激素(TSH)水平异常的比例占12.6%,其中甲状腺功能减退症的患病率高达10.1%。HbA1c与甲状腺激素呈负相关,控制年龄、性别、病程、BMI后,这种相关性仍存在,而且有统计学意义(P<0.05)。按照糖化血红蛋白(HbA1c)水平分为四组,即HbA1c<7%、7%≤HbA1c<10%、10%≤HbA1c<13%、HbA1c≥13%。组间TSH、FT3、TT3的水平呈下降趋势,差异有统计学意义(P均<0.05);HbA1c≥13%组FT3水平显著低于其余三组。组间FT4、TT4水平比较,差异无统计学意义(P均>0.05)。甲状腺激素与血脂各组分之间未发现显著的统计学意义(P均>0.05),控制年龄、性别、病程、BMI、HbA1c后仍未表现出相关性。结论:2型糖尿病患者中甲状腺功能异常的患病率较高,而甲状腺功能减退症的患病率显著高于其他甲状腺疾病组。HbA1c水平升高组FT3的水平显著下降,提示FT3降低与血糖控制不佳及糖尿病病情程度有关,FT3可能是糖尿病患者不良预后的预测因子。

西格列汀治疗2型糖尿病31例疗效观察

目的:探讨西格列汀对2型糖尿病胰岛素抵抗及相关炎症因子的影响。方法:选取2型糖尿病患者62例,随机分为观察组和对照组各31例。对照组给予2型糖尿病常规治疗,观察组在常规治疗基础上给予西格列汀治疗。结果:观察组患者临床治疗总有效率(90.32%)高于对照组临床治疗总有效率(67.74%),差异有统计学意义。治疗后,观察组糖尿病患者胰岛素抵抗指标,如体重指数(BMI)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及空腹胰岛素水平(FIns)均低于对照组,差异有统计学意义。治疗后,观察组糖尿病患者空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2hPG)及糖化血红蛋白(HbA1c)水平低于对照组,差异有统计学意义。治疗后,观察组糖尿病患者脂代谢指标低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平低于对照组,差异有统计学意义。结论:西格列汀治疗2型糖尿病患者疗效显著,能够显著降低胰岛素抵抗,对2型糖尿病患者血糖控制及脂代谢调节具有较佳效果。

2型糖尿病患者糖化血红蛋白水平与红细胞流变学相关性研究

目的:了解2型糖尿病患者糖化血红蛋白水平与洗涤红细胞流变学之间的关系。方法:测定152例2型糖尿病患者及115例正常对照人群的空腹血糖、糖化血红蛋白、洗涤红细胞粘稠度,分析糖化血红蛋白水平与洗涤红细胞流变学之间的相关性。结果:2型糖尿病患者的洗涤红细胞粘稠度、全血粘度、红细胞聚集指数、红细胞变形指数,均明显高于正常对照组;洗涤红细胞粘度、血浆粘度与糖化血红蛋白正相关。结论:2型糖尿病患者洗涤红细胞流变学的异常改变与血糖增高有关,长期高血糖可影响2型糖尿病患者的血流变性指标。

离子交换HPLC和LPLC测定HbA1c的比较

【目的】离子交换高性能液体色谱法(HPLC)和离子交换低性能液体色谱法(LPLC)测定糖化血红蛋白(HbA1c)的比较。【方法】采用离子交换HPLC和LPLC测定100例糖尿病患者的HbA1c值,两组结果进行相关分析,并做χ2检验;两种HbA1c质控各测5次。【结果】100例HbA1c的平均值为:HPLC:8.15±2.27,LPLC:8.33±2.43,两种方法测定值的相关性好,回归方程为Y=0.96X+0.53,相关系数(r)为0.99,P<0.01,n=100。χ2=0.65,有极好的一致性。两种方法测定质控结果均接近靶值,CV值小。【结论】HPLC和LPLC测定HbA1c的相关性好,均为可靠测定HbA1c的方法。