藤黄微球菌海藻糖生物合成基因的克隆与鉴定

首次从一株能利用淀粉产生海藻糖的藤黄微球菌中克隆了海藻糖生物合成基因。采用PCR方法结合非随机鸟枪法得到藤黄微球菌中低聚麦芽糖苷基海藻糖合成酶(MTSase)基因(MtreY)的全序列及低聚麦芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)基因(MtreZ)的部分序列,其中MtreY共有2,370个碱基,编码789个氨基酸,表达产物分子量为86·7kD。同源性分析表明,与已报道的MTSase和α-淀粉酶家族成员具有相同的保守模体。将MtreY基因在大肠杆菌JM83中表达,证明表达产物具有预期的酶活性。

禽致病性大肠杆菌fdtACB基因缺失株的生物学特性研究

为研究O抗原侧链岩藻糖合成酶基因fdtACB对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究以O_(2)血清型APEC DE17为亲本株,通过Red同源重组构建fdtACB基因缺失株与回补株,经PCR及测序鉴定确认缺失株ΔfdtACB和回补株CΔfdtACB均正确构建。采用硝酸银染色法鉴定细菌脂多糖(LPS)图谱,采用western blot鉴定缺失株与O_(2)血清型O因子血清的反应性。硝酸银染色法结果显示,ΔfdtACB缺失株未产生与野生株一样完整的LPS图谱,表现为部分O抗原梯状条带缺失和移位;western blot结果显示,ΔfdtACB与大肠杆菌O_(2)血清型O因子血清无反应条带。各菌株培养16 h后每隔1 h测定OD600nm值,绘制生长曲线;于半固体培养基培养各菌株,通过测量细菌运动圈直径分析各菌株的运动能力,通过结晶紫染色法检测各菌株生物被膜(BF)形成能力,结果显示,ΔfdtACB缺失株、野生株和回补株间生长速率无明显差异(P>0.05);与野生株相比,ΔfdtACB缺失株的运动能力显著降低(P<0.01),BF形成能力显著升高(P<0.01)。以上结果表明fdtACB影响细菌O抗原完整性、运动及BF的形成。将各菌株分别感染DF-1细胞后通过细菌计数分析APEC对细胞的黏附及侵袭力,结果显示,ΔfdtACB对DF-1细胞的黏附及侵袭力均较野生株极显著降低(P<0.01)。以不同浓度各菌株腹腔注射感染大蜡螟后,根据5 d内各组大蜡螟死亡数量计算各菌株LD50,结果显示,除高剂量各菌株外,其它剂量各菌株注射后,ΔfdtACB组大蜡螟死亡数较其它组少,经计算野生株LD50为1.85×10^(2) cfu/mL,缺失株LD50为9.16×10^(2) cfu/mL,回补株LD50为8.0×10^(1) cfu/mL,缺失株致病力比野生株降低约5倍,表明fdtACB影响细菌感染性和致病力。综上所述,本研究首次证实大肠杆菌岩藻糖合成酶FdtACB参与O_(2)型APEC O的抗原合成,在细菌运动、BF形成和感染过程中发挥作用,该结果对掌握APEC O抗原侧链的生物学功能具有重要意义。

海藻糖的MTSase及MTHase酶促合成条件的研究

本室收藏一株产 MTSase和 MTHase两酶并能将淀粉水解物转化为海藻糖的菌株 Micrococcus luteus。实验发现 ,菌体在对数生长期细胞内的 MTSase和 MTHase累积量极少 ,但在其基本停止生长后继续培养 12 h,胞内MTSase和 MTHase两酶含量急剧增加。两酶联合作用的最适反应条件为 p H6 .5 ,温度 4 0℃ ;最适底物是 DE值为11.6、浓度为 15 %的淀粉水解液。

改造糖基侧链合成新型抗生素的研究进展

放线菌抗生素核心结构普遍存在糖基化,糖基在抗生素药理作用的发挥中起到了非常重要的作用。随着抗生素糖基合成基因簇研究的深入,运用现代基因工程技术,借助糖基转移酶的底物灵活性,已实现了多种抗生素糖基侧链的改造,进而合成新结构的抗生素。文中详细介绍了目前抗生素糖基侧链改造的主要方法,以及运用基因工程技术对糖类合成途径进行调控以产生新型糖基化衍生物的研究进展。

以淀粉为原料双酶法生产海藻糖的研究进展

双酶法生产海藻糖是指以淀粉为原料,在低聚麦芽糖基海藻糖合成酶和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶两种酶的协同作用下,将一定链长的直链淀粉转化成海藻糖的技术。双酶法作为最早实现工业酶转化生产海藻糖的方法,起源于日本,具有原料便宜易得、工艺较成熟、不需要高能量化合物等优点。文章重点介绍了双酶法在国外(尤其是日本)及国内的发展及应用。随着生物基因工程技术的发展,越来越多性能优异的低聚麦芽糖基海藻糖合成酶和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶被提取、优化和构建,为双酶法工艺的进一步完善和工业化提供了可能。

启动子工程提高海藻糖生产用酶在地衣芽孢杆菌中的表达

麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltosyltrehalose synthase,MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltosyltrehalose hydrolase,MTHase)是酶法合成海藻糖的关键酶。由于该酶系在天然菌种内产量极低,研究者相继在各种模式微生物中对该酶系编码基因进行表达。为了实现MTSase和MTHase在食品安全级菌株的分泌表达,本研究选择重要工业微生物地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)作为宿主菌株,以MTSase为报告蛋白,通过对天然启动子进行筛选,发现P_(P2)介导下MTSase的表达量最高,在此基础上利用启动子工程策略构建了一系列串联启动子及合成启动子,发现合成启动子P_(1-P2)在原有P_(P2)基础上将MTSase的表达量提高了37%,该启动子对于MTHase的表达同样具有提高作用,在P_(1-P2)介导下MTHase的表达量较在P_(P2)介导下的提高了10%。在发酵培养基和P_(1-P2)启动子介导下MTSase和MTHase的酶活力分别可以达到6907.9 U/mL和798.5 U/mL。