牛甘露聚糖结合凝集素A基因糖基识别域生物信息学特征的研究

研究牛甘露聚糖结合凝集素A基因糖基识别域的分子特征,从生物信息学角度说明MBL功能的发挥主要依赖其糖基识别域.从牛肝脏组织中提取总RNA,经RT-PCR技术扩增MBL-A基因糖基识别域,与pMD18-T载体连接并测序.牛MBL-A分子CRD结构的分析,为进一步研究其识别效应和MBL介导的天然免疫防御功能的机制提供依据.

Balb/c小鼠MBL-C糖识别域的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达Balb/c小鼠肝型甘露聚糖结合凝集素(mMBL-C)糖识别域(CRD)并制备其多克隆抗体。方法应用PCR从含Balb/c小鼠MBL-C全长编码区基因的质粒pmMBL-C中扩增目的基因片段,构建重组表达载体,在大肠杆菌中表达。分离纯化表达产物并免疫动物,制备mMBL-C CRD的抗血清,采用ELISA和Western blot鉴定其效价和特异性。结果从pmMBL-C中扩增到约450 bp的DNA片段,构建重组载体pET-CKS-mMBL-C-CRD和pET32a-mMBL-C-CRD,经酶切和测序鉴定,证实重组表达载体构建成功。将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物主要以包涵体的形式存在,相对分子质量(Mr)分别为44 000和34 000。利用pET-CKS载体表达产物免疫家兔,分离免疫血清后,使用pET32a(+)载体表达产物进行ELISA及Western blotting,显示多克隆抗体能够与mMBL-C CRD蛋白特异结合。结论获得了重组mMBL-C CRD蛋白及其多克隆抗体,为mMBL-C分子以及CRD的研究奠定了一定的基础。

草鱼胶原凝集素基因的克隆及其功能分析

从草鱼Ctenopharyngodon idella肝肾cDNA文库中克隆得到胶原凝集素基因。草鱼胶原凝集素全长cDNA为1128bp,其中5′非编码区229bp,3′非翻译区104bp,最大开放阅读框为795bp,编码264个氨基酸。系统进化分析表明草鱼胶原凝集素与斑马鱼的亲缘关系最近。根据草鱼胶原凝集素序列特征,克隆了包含糖基识别域(CRD)的cDNA,并进行原核表达、纯化获得其重组蛋白PCRD。进行PCRD与6种细菌的凝集和糖抑制实验,结果表明半乳糖、葡萄糖、甘露糖和麦芽糖4种糖都会使PCRD与嗜水气单胞菌的凝集明显下降甚至极大地干扰凝集;麦芽糖使金黄色葡萄球菌的凝集明显下降,而肽聚糖和甘露糖会使凝集受到抑制;此外,PCRD的凝集反应不依赖Ca2+。