梭梭糖基转移酶基因克隆及序列分析

以梭梭叶片为材料,根据其他植物糖基转移酶基因的保守序列设计引物,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法克隆到2个同源的序列,分别命名为HaUGT1和HaUGT2。基因测序结果显示,HaUGT1基因编码区长1 485bp,编码495个氨基酸;HaUGT2基因编码区长1 185bp,编码394个氨基酸。HaUGT1和HaUGT2蛋白具有保守的PSPG基序、UDP-葡萄糖基转移酶结构域,与其他植物中的糖基转移酶蛋白同源性较高。

益母草糖基转移酶基因的克隆及原核表达分析(英文)

通过cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends,RACE）从益母草（Leonurus heterophyllus Sweet）叶片中克隆获得了一个编码糖基转移酶的基因（LhsUGT）。该基因cDNA全长为1562 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）为1368 bp,编码455个氨基酸残基,其分子量和等电点分别为50.47 k D和5.52。生物信息学分析结果显示：LhsUGT编码的酶蛋白含有3种二级结构,其中α螺旋占43.1%,β折叠片占17.5%,无规卷曲占39.4%,其C端还发现了一段高度保守的PSPG结构域,说明LhsUGT编码的酶蛋白属于植物糖基转移酶超家族;对LhsUGT的氨基酸序列进行BLAST同源比对,发现益母草与其它植物的糖基转移酶序列相似性为26.4%-68.0%;系统进化树分析表明,LhsUGT蛋白属于拟南芥糖基转移酶超家族的L组,故推测它可能具有催化简单酚类发生糖基化的功能;SDS-PAGE电泳显示,原核表达系统成功表达出分子量约为69 k D的LhsUGT重组蛋白,其N端含有一段17.9 k D的His标签,且在IPTG诱导5 h后达到最高表达量。本研究结果为进一步开展体外酶促反应、阐明益母草糖基转移酶的生物学功能奠定了基础。

七叶一枝花中尿苷二磷酸糖基转移酶基因的筛选和分析

重楼皂苷是重楼(Paridis rhizoma)中最重要的药用成分,但其生物合成途径仍不完全清楚.有研究表明,尿苷二磷酸糖基转移酶(uridine diphosphate glycosyltransferase,UGT)是重楼皂苷生物合成下游步骤的关键酶.为此,利用生物信息学工具及qRT-PCR技术,对七叶一枝花(Paris polyphylla var.Chinensis)转录组数据库中UGTs的基因结构、系统进化、基因表达特征及其蛋白质理化性质和蛋白质结构等进行了分析,共得到45个UGTs基因,其主要分布在9个组及家族中;同时还获得了与重楼皂苷合成密切相关的UGT73和UGT80亚家族中的5个候选UGTs.表达量分析表明,5个候选UGTs多在叶或花中的表达量较高.研究结果可为进一步探究UGT家族的基因功能,以及深入解析重楼皂苷合成途径提供理论参考.

普通野生稻(Oryza rufupogon)糖基转移酶基因OrGT1(t)的克隆与表达分析

【目的】对野生稻中木糖基转移酶基因开展初步研究,为进一步探索单子叶植物中木葡聚糖的合成及功能研究打下坚实的基础。【方法】利用同源克隆的方法,从普通野生稻(Oryza rufipogon)中克隆了1个糖基转移酶基因OrGT1。【结果】序列分析结果显示:该基因具有1个保守的Glyco-transf-34结构域,属于糖基转移酶34家族的基因。系统进化分析表明:该基因可能是1个木葡聚糖合成中的木糖转移酶基因。实时荧光定量分析表明:该基因在普通野生稻的在根、茎、叶和穗中均有表达,但在不同组织中表达有明显差异,其中茎的表达量最高,而根中的表达量最低。【结论】OrGT1基因在进化过程中高度的功能保守性,推测OrGT1(t)基因可能是1个参与木葡聚糖合成的木糖基转移酶基因,该研究结果为进一步探索该基因的功能打下良好的基础。

‘秋天火焰’槭类黄酮糖基转移酶基因(UFGT)片段的克隆及序列分析

为了从分子层面研究槭树秋季叶片花青苷的合成机理,克隆其花青苷合成相关酶类黄酮糖基转移酶基因(UFGT)全长。以槭树‘秋天火焰’叶片为试材,利用改良的CTAB法提取总RNA,以总RNA为模板,设计简并引物,采用RT-PCR方法扩增出UFGT基因的cDNA片段,该基因片段长397bp,编码132个氨基酸。序列分析结果表明,该cDNA片段与GenBank中报道的荔枝、木薯等物种的氨基酸同源性在50%～60%之间,GenBank登录号为KC140229,试验结果为进一步克隆槭树UFGT基因全长奠定基础。

烟草糖基转移酶基因启动子片段B的克隆与诱导表达

利用从烟草中克隆的一个新糖基转移酶(Glucosyitransferase,GTs)基因启动子中具有茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)双重诱导的片段,与GUS(β-glucuronidase)报告基因连接,构建部分启动子片段缺失载体。利用农杆菌介导的叶盘转化法,获得了转基因植株,不同片段载体转基因植株的阳性率为50%～71%。对阳性转基因烟草植株GUS诱导活性的定量分析结果表明,在构建的4个表达载体中,启动子片段BA的基础表达水平非常低,并且不同转基因植株中都存在SA和MeJA双重诱导特征;片段BB和BC基础表达水平较高,不同转基因植株对SA和MeJA的反应不同;对于启动子片段BD,基础表达高于BA片段而低于BB和BC,不同转基因植株GUS活性均受SA诱导。推测在-756～-703之间(BA)存在MeJA和SA双重诱导元件,在-643～-606存在SA的诱导元件。对这些诱导元件的确定,有助于水杨酸和茉莉酸甲酯诱导机理的研究。

甜菊(Stevia rebaudiana)糖基转移酶基因的克隆及序列分析

利用与植物次生代谢产物糖基化相关的UDPG糖基转移酶的特征性保守区域 ,设计了同源简并引物 ,以甜菊基因组DNA为模板 ,PCR扩增获得甜菊糖基转移酶基因片段 .根据获得的基因片段设计引物GSTr和GSTf,分别与cDNA文库的T3 和T7通用引物扩增获得全长核苷酸序列的甜菊糖基转移酶基因 ,定名为sudpt 2 ,该基因全长 16 6 2bp ,包括poly(A)和一个 136 2bp的开放阅读框 ,编码 45 4个氨基酸 .与常见的糖基转移酶基因的相似性达 44 %～ 77% ,且具有UDPG糖基转移酶的特征性保守序列 .分子发育进化分析表明 。

森林草莓糖基转移酶基因家族生物信息学及其表达分析

【目的】对森林草莓糖基转移酶基因(FvUGT)家族进行生物信息学分析及基因表达分析,为深入研究森林草莓UGT基因功能和探索UGT调控草莓果实发育及花色苷及品质形成提供理论依据。【方法】基于Phytozome数据库鉴定得出138个FvUGT基因家族基因,运用生物信息学方法分析其蛋白理化性质、基因结构、保守结构域和进化关系,并采用实时荧光定量PCR对UFGT候选基因在森林草莓(红果和白果2个类型)各组织(根、叶柄、叶和果实)中的表达量进行分析。【结果】FvUGT基因家族可分为12个类群(A、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和N),每个类群分别包含16、2、23、32、8、1、5、5、7、3、21和4个成员;染色体定位发现FvUGT基因家族成员在除2号染色体之外的其他染色体上均有分布,且分布不均;FvUGT基因内含子长度、外显子位置和数目在不同成员间均存在差异,FvUGT基因家族在进化过程中产生较强的分化。实时荧光定量PCR检测结果表明,FvUFGT70基因在森林草莓白果和红果的叶和叶柄中有较高表达;FvUFGT94基因在各组织中均有表达;FvUFGT67和FvUFGT68基因在根中有较高表达;而FvUFGT95和FvUFGT96基因在果实中有表达,且显著高于其他组织(P<0.05,下同)。同时,在果实的小绿期、转色期和成熟期的表达表现为,成熟期FvUFGT33和FvUFGT95这2个基因在森林草莓红果类型的表达量显著高于白果类型。【结论】7个FvUFGT基因表现出明显的组织差异性,其中FvUFGT33和FvUFGT95基因在果实中有较高表达量,且在森林草莓红果类型表达量显著高于白果类型,故推测其在花色苷合成中发挥作用。

紫云英根瘤菌糖基转移酶基因exoL的定位突变及序列分析

利用转座子Tn5对质粒pJB-B6既定位诱变，经同源交换，筛选获得一株Rhizobiumhuakuii107胞外糖合成缺陷（Exo－）变种RH983。三亲本杂交实验显示，pJB-B6及其亚克隆pJB-B601均可纠正变种RH983的胞外多糖合成缺陷。pJB-B601的2．3kbDNA片段的核苷酸顺序表明，该片段内存在一个完整的开放阅读框架（ORF）。ORF全长1170bp，编码390个氨基酸的蛋白，该蛋白与Rhi－zobiummeliloti的糖基转移酶ExoL有56．7％．的同源性，称为RhexoL。利用启动子探测质粒，构建了RhexoL-lacZ转录融合子，发现RhexoL基因5’上游有较强的启动子活性。

大豆类黄酮糖基转移酶基因UGT73C19的功能研究

【背景】类黄酮是大豆中积累的一类重要的植物次生代谢产物,参与大豆的生长、发育和抗逆等诸多生理活动。由UDP-糖基转移酶(UGT)催化的糖基化修饰是类黄酮生物合成的关键步骤。【目的】通过系统研究大豆UGT73C19编码重组酶的体外酶活特性和体内特性,完善大豆黄酮类化合物合成和积累的机制,为大豆品质的遗传改良提供基因资源和理论基础。【方法】通过高效液相色谱(HPLC)的方法检测大豆核心种质资源叶片中类黄酮的种类和含量,通过qRT-PCR的方法检测了UGT的表达水平。以大豆Williams 82叶片cDNA为模板,克隆得到UGT73C19的编码区序列。使用MEGA5和DNAMAN软件进行多重序列比对,并构建进化树。通过原核表达系统获得UGT73C19的重组蛋白,分析UGT73C19重组蛋白对各种类黄酮苷元的糖基转移活性,并通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)对产物进行鉴定,确定重组蛋白的糖基化位点。利用qRT-PCR技术对UGT73C19在大豆不同组织的表达水平进行分析。构建植物过量表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,获得UGT73C19表达量高的纯合株系,检测转基因株系叶片和种子中类黄酮的种类和含量。【结果】通过HPLC分析大豆核心种质资源叶片类黄酮成分,发现不同品种中类黄酮的成分和含量存在明显差异。根据类黄酮成分的不同,将大豆核心种质分为12种不同的类型。大豆核心种质资源叶片中总黄酮的含量与UGT73C19的表达水平呈正相关关系。克隆得到UGT73C19的编码区序列,全长1482 bp,编码493个氨基酸,UGT73C19蛋白在C-端有一个保守的PSPG结构域。体外酶活分析表明,重组的UGT73C19蛋白对6种类黄酮苷元(山奈酚、槲皮素、杨梅素、芹黄素、大豆苷元和染料木素)都具有糖基转移活性,其中对槲皮素的催化效率最高;糖基化位点分别位于类黄酮的5位和7位羟基上,重组UGT73C19蛋白的糖基化底物和位点具有多样性。过量表达UGT73C19的拟南芥叶片和种子中的类黄酮总量明显升高,其中叶片中总黄酮含量提高49%—70%,种子中总黄酮的含量提高34%—37%;尤其是种子中槲皮素3-O鼠李糖的含量显著增加。【结论】UGT73C19蛋白是催化合成大豆中多个类黄酮糖苷的关键糖基转移酶,过量表达UGT73C19可以提高转基因植物中黄酮醇糖苷和类黄酮的含量。

发菜中糖基转移酶基因的克隆及原核表达

发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生蓝藻,前期转录组测序发现糖基转移酶基因转录水平较正常上调2.29倍.以发菜基因组为模板克隆糖基转移酶基因,获得长度为1 290bp的核酸序列.通过生物信息学分析表明,通过生物信息学分析表明,该基因具有较高保守性,蛋白质二级结构主要构成方式为随机卷曲和α螺旋,是亲水性蛋白,酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸磷酸化位点个数分别为2、9、18,蛋白质分子量为47.54kDa,等电点为9.33.正负电荷氨基酸残基数分别为61和51.随后,将该基因插入质粒pET-28a中成功构建重组表达质粒,然后转化至BL21大肠杆菌感受态中进行原核表达.在OD值为0.8时,用1mM IPTG在16℃下诱导表达20h后,获得预期大小重组蛋白(47.54kDa).研究首次成功克隆得到发菜糖基转移酶基因,并构建重组质粒于大肠杆菌中高效表达,实验结果为进一步研究发菜多糖代谢分子调控机制奠定了基础,也为今后糖基转移酶基因工程菌株的构建提供理论依据.

金鱼草花青素糖基转移酶基因的克隆与表达特性分析

以白苏子(Perilla frutescens)花青素糖基转移酶基因为探针,通过电子克隆和RT-PCR的方法从金鱼草(Antirrhinum majus L.)叶片中克隆到花青素糖基转移酶基因(Am GT1)的全长c DNA,并对其表达特性进行分析。结果表明:Am GT1全长892 bp,编码277个氨基酸;进化分析表明Am GT1的氨基酸序列与白苏子的同源性最高为79%,与其他花青素糖基转移酶蛋白的同源性在42%~62%之间,表明Am GT1是从金鱼草中克隆的新的花青素糖基转移酶基因。实时定量RT-PCR分析表明:该基因在金鱼草叶片中的表达量最高,根中的表达量最低;该基因虽然在红色、粉色、黄色、白色花朵中均有表达,但在红色花朵中的表达量最高,且存在一个从紧蕾期到松蕾期的跃变。

一个烟草葡糖基转移酶基因启动子的克隆与诱导表达

中南民族大学生命科学学院李静、刘学群和王春台3位科研工作者利用从烟草中克隆的一个葡糖基转移酶基因（GT—like），通过PCR扩增得到该基因开放阅读框5’端-1150～0上游调控区，经序列分析表明该启动子序列含有多个基因表达调控元件。将GT—Like基因启动子与gus报告基因连接，构建植物表达载体pGT-gus，经根癌农杆菌介导法转化W38型烟草。转基因烟草植株GUS组织化学染色结果表明：

糖基转移酶基因双敲除对依博素生物合成的影响

以往研究已确定链霉菌胞外多糖依博素的生物合成基因簇(ste),ste15和ste22分别编码葡萄糖糖基转移酶和鼠李糖糖基转移酶。现通过基因同源重组双交换,在ste15基因缺失突变株Streptomyces sp.139(ste15-)基础上,再进行ste22基因阻断,经Southern杂交验证,得到了ste15和ste22双基因缺失突变株Streptomycessp.139(ste15-ste22-),并对该菌株进行了基因互补研究。双基因缺失株产生的胞外多糖与依博素相比,葡萄糖与鼠李糖含量明显降低,分子量下降,生物活性明显变弱。基因互补株产生的胞外多糖中葡萄糖与鼠李糖含量基本恢复至依博素水平,生物活性也显著提高。因此,进一步阐明了ste15和ste22基因参与了依博素生物合成中葡萄糖和鼠李糖重复单元序列的形成过程,在依博素的生物合成中起重要作用,变株产生的依博素新衍生物体内外生物学活性正在深入研究中。

下调糖磺基转移酶4基因表达对食管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨糖磺基转移酶4(CHST4)基因对食管癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法通过基因表达谱在线分析平台(GEPIA)分析CHST4基因在食管癌患者和正常人中的表达。通过shRNA技术干扰CHST4在食管癌细胞中的表达,然后通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测CHST4的干扰效果。采用CCK-8、克隆形成、划痕、Transwell、流式细胞和Western blot等技术分析阴性对照组和sh-CHST4组食管癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡和相关蛋白的表达。结果通过GEPIA分析发现CHST4在食管癌患者中的表达高于正常人(P<0.05);CHST4在食管癌细胞中的表达高于正常食管上皮细胞(P<0.05);相比阴性对照组,sh-CHST4组细胞的增殖和克隆形成能力降低,细胞的迁移和侵袭能力降低,细胞凋亡增加,细胞迁移相关蛋白的表达降低(P<0.05)。结论CHST4基因在食管癌的发生和发展中起促进作用,除此之外,CHST4基因能够成为治疗食管癌的理想靶点。

北柴胡糖基转移酶基因BcUGT8的克隆、序列分析及其原核表达载体构建

目的克隆北柴胡Bupleurum chinense中可能参与柴胡皂苷生物合成的糖基转移酶基因BcUGT8,构建其原核表达载体,为通过体外表达和纯化蛋白的催化活性,分析验证其功能奠定基础。方法在Roche(454)GS FLX系统高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)和长距离PCR扩增方法(LD-PCR)克隆全长cDNA。设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增其开放阅读框(ORF),酶切后,插入到pET-28a(+)载体中,构建出原核表达载体。结果扩增到北柴胡1个糖基转移酶(UGT)基因全长cDNA,构建了这一基因的原核表达载体。结论通过BcUGT8基因的全长cDNA克隆、序列分析和原核表达载体的构建,为后续开展体外酶蛋白表达、纯化和催化活性分析实验,验证其生物功能奠定了基础。

产黑普雷沃氏菌糖基转移酶基因的扩增和序列分析

产黑普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)属革兰阴性专性厌氧菌,是引起牙周疾病的病原之一。为了研究牙周炎患者产黑普雷沃氏菌是否存在及其分子特征,用棉签刮取患者口腔,沸水-液氮法破碎细胞,同时设计产黑普雷沃氏菌糖基转移酶基因的1对引物,利用常规PCR方法扩增产黑普雷沃氏菌糖基转移酶基因。经NCBI序列相似性比对,发现该患者感染的产黑普雷沃氏菌糖基转移酶基因核苷酸序列与P.melaninogenica ATCC 25845菌株的糖基转移酶基因(Gen Bank accession No.CP002122)同源性最高,达92%;其编码的糖基转移酶部分氨基酸序列与P.melaninogenica菌株的甘露糖糖基转移酶(Gen Bank accession No.WP_013264679)同源性最高,达98%。以糖基转移酶部分氨基酸序列构建系统进化树,结果表明,本试验获得的产黑普雷沃氏菌与其它报道的P.melaninogenica菌株同源性最高,属于同一组(group)。

刺五加糖基转移酶基因的表达及其对皂苷含量的影响

为了探明刺五加糖基转移酶基因(glycosyltransferase,GT)的表达特点及其对刺五加总皂苷含量的影响。以GAPDH基因为内参照基因,采用实时定量PCR技术分析了不同产地、不同生长发育时期、不同器官刺五加中GT基因的表达规律及茉莉酸甲酯(MeJA)对其表达的影响。并采用浓硫酸-香草醛比色法测定刺五加总皂苷的含量,利用SPPS17.0软件进行相关性分析。结果表明,GT基因在根、幼茎、叶片和叶柄中均有表达,但表达量差异不显著。刺五加的GT基因在叶片完全展开期的表达量最高,盛花期和果实基本成熟期的表达量最低,仅为叶片完全展开期表达量的66.9%。MeJA处理可显著提高GT基因的表达量(p<0.05)。不同产地刺五加的GT基因表达量和总皂苷含量差异显著,但GT基因的表达量与总皂苷含量同升同降,存在极显著的正相关关系(p<0.01)。初步判定,GT基因的表达量决定了刺五加中总皂苷的含量,GT是决定刺五加中总皂苷含量的关键酶。

基于牡丹类黄酮糖基转移酶基因建立VIGS技术体系

牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)花色的化学基础研究较为深入,但因其无遗传转化体系,导致花色相关基因的功能验证只能利用其他植物进行旁证。利用保守区段长分别为413和418 bp的牡丹花瓣类黄酮糖基转移酶基因PsUF3GT和PsUF5GT,通过VIGS表达载体,采用二因素三水平的试验体系对目的基因进行沉默。结果表明,PsUF3GT和PsUF5GT的表达量在花斑中(盛开期花瓣,真空抽滤15 min)和非斑中(蕾期花瓣,真空抽滤10 min)分别比空载体处理的花斑中(盛开期花瓣,真空抽滤10 min)和非斑中(蕾期花瓣,真空抽滤15 min)降低了65.0%和85.0%;花斑中总花青苷含量分别降低了24.2%和28.2%,尤其是盛开期花瓣(真空抽滤15 min)处理后3G型糖苷降低了92.2%,蕾期花瓣(真空抽滤10 min)处理后3G5G型糖苷降低了54.9%。由此获得了沉默PsUF3GT和PsUF5GT的适宜体系:以盛开期或者花蕾期带花柄的花朵为材料,抽真空渗透10~15 min后,置于去离子水中暗培养1 d(8℃,湿度60%);之后转移至23~25℃、湿度60%的环境,光照培养3 d后可用于检测和分析。本研究中建立的VIGS体系可有效沉默花瓣中的内源基因,为牡丹基因功能验证及其花色形成的分子机制研究奠定了基础。