消瘀泄浊饮对糖尿病肾病小鼠肾脏足细胞凋亡及HIF1α表达的调控作用

[目的]探讨消瘀泄浊饮对糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)小鼠肾脏足细胞凋亡的保护作用及对低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF1α)的影响。[方法]选用6只db/m小鼠为阴性对照组,18只db/db小鼠随机分为DKD模型组、低剂量消瘀泄浊饮组、高剂量消瘀泄浊饮组,每组6只。灌胃12周后,检测尿液中尿蛋白、β_(2)-微球蛋白(β_(2)-microglobulin,β_(2)-MG)、尿白蛋白/肌酐(albumin/creatinine ratio,Acr)、尿β_(2)-微球蛋白/肌酐(β_(2)-microglobulin/creatinine ratio,β_(2)-MG/Ucr)及血清甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、白蛋白(albumin,Alb)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,Scr)的水平。分离肾组织,光镜及电镜下观察肾组织病理变化;组织匀浆后用实时聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测HIF1α、nephrin mRNA水平。[结果]与阴性对照组比较,DKD模型组小鼠的尿蛋白、尿β_(2)-MG、Acr、β_(2)-MG/Ucr,血清TG、TC、BUN、Scr水平升高(P<0.01),血清Alb下降(P<0.01);肾小球体积增大,毛细血管袢呈分叶状,系膜细胞及基质增生,间质炎症及纤维化程度加重,足突融合增加,基底膜增厚,足细胞凋亡增加;肾组织HIF1αmRNA表达升高(P<0.01),nephrin mRNA表达下降(P<0.01)。与DKD模型组比较,高、低剂量消瘀泄浊饮组的尿蛋白、尿β_(2)-MG、Acr、β_(2)-MG/Ucr,血清TG、TC、BUN、Scr水平下降(P<0.01),血清Alb水平升高(P<0.01);肾小球、肾间质、足突病变明显改善,足细胞凋亡减少;肾组织HIF1αmRNA表达下降(P<0.01),nephrin mRNA表达升高(P<0.01)。高、低剂量消瘀泄浊饮组间尿蛋白、β_(2)-MG、Acr、β_(2)-MG/Ucr,血清TG、TC、BUN、Scr、Alb水平和肾组织HIF1α、nephrin mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]消瘀泄浊饮能改善DKD小鼠尿蛋白、肾功能及肾脏结构病变、足细胞凋亡等指标,其可能通过调节HIF1α表达发挥作用。

中药干预足细胞凋亡治疗糖尿病肾病研究进展

糖尿病肾病(DN)的发病机制十分复杂,足细胞丢失在其发生、发展过程中起着重要作用,可导致肾功能受损,而细胞凋亡是足细胞丢失的主要原因,因此干预足细胞凋亡对于延缓DN进程有着重要意义。中药具有多靶点及多途径的特殊优势,近来许多研究发现中药在干预足细胞凋亡方面有良好的疗效,但缺乏系统性的综述。本文对中药干预足细胞的内源性凋亡、外源性凋亡、内质网应激凋亡三条途径,抑制足细胞凋亡治疗DN进行综述,以期为今后DN的治疗提供参考。

沉默FOXM1对糖尿病肾病小鼠炎症反应、足细胞凋亡及干细胞蛋白的影响研究

目的:观察沉默FOXM1对糖尿病肾病(DN)小鼠炎症反应、足细胞凋亡及干细胞蛋白的影响。方法:30只小鼠随机等分为空白对照组、DN模型组和沉默FOXM1组。空白对照组正常喂养。DN模型组和沉默FOXM1组高脂肪饮食构建DN模型后,DN模型组正常喂养,沉默FOXM1组给予Fox M1-shRNA慢病毒静脉注射。比较三组小鼠一般反应情况、光镜肾皮质病理、肾功能指标、炎症指标、足细胞凋亡及干细胞蛋白等观察指标的差异。结果:沉默FOXM1组的体重、进食量、饮水量与空白对照组比较(P>0.05),但均重(或多)于DN模型组(P<0.05)。与DN模型组相比,沉默FOXM1组的肾小管底膜增厚、肾小球体积增大、系膜基质增生、炎性反应均改善。与空白对照组相比,DN模型组和沉默FOXM1组的足细胞凋亡数增加,但沉默FOXM1组的足细胞凋亡数低于DN模型组(P<0.05)。与空白对照组相比,DN模型组和沉默FOXM1组的肾功能指标(Alb、KIM-1)、炎性因子(TNF-α、CRP、IL-2)、干细胞蛋白(Oct4、Sox2)均提升,但沉默FOXM1组的肾功能指标(Alb、KIM-1)、炎性因子(TNF-α、CRP、IL-2)、干细胞蛋白(Oct4、Sox2)低于DA模型组(P<0.05)。结论:沉默FOXM1能减少DN小鼠24 h尿白蛋白排泄,减轻肾脏损伤,降低炎性反应,抑制足细胞凋亡,改善干细胞蛋白表达,可能为DN治疗的一个靶向基因。

金匮肾气汤对糖尿病肾病小鼠足细胞凋亡信号的影响

目的探讨金匮肾气汤对db/db糖尿病小鼠肾脏足细胞凋亡的影响及机制。方法将6周龄db/db糖尿病小鼠随机分为生理盐水组、金匮肾气汤组、二甲双胍组,均灌胃给药;♂db/m小鼠作为正常对照组。于18周龄处死动物,取血检测血糖,留24h尿检测尿白蛋白;留取肾脏组织,分别进行PAS染色观察肾小球内系膜增生情况,透射电镜观察肾小球内足细胞足突情况,免疫荧光检测podocin在肾组织的表达,Western blot检测caspase-3、p-Bcl-2、p-JNK1/JNK1在肾组织的表达。结果与db/db糖尿病小鼠比较,金匮肾气汤治疗后,24h尿白蛋白水平降低,肾小球内系膜增宽程度减轻,肾小球内足细胞足突倒伏、融合明显减轻,肾小球内podocin线样荧光明显增强,肾皮质内caspase-3表达明显降低(P<0.05),JNK1和Bcl-2磷酸化明显下调(P<0.05)。结论金匮肾气汤通过JNK1/Bcl-2信号途径,改善足细胞凋亡,保护足细胞,延缓糖尿病肾病的进展。

下调miR-150-5p调控PI3K/AKT信号通路抑制体外糖尿病肾病足细胞模型凋亡的机制研究

目的:探讨下调miR-150-5p调控PI3K/AKT信号通路对体外糖尿病肾病足细胞模型凋亡的影响和机制。方法:以小鼠足细胞MPC5作为研究对象,分成Control(空白对照)、Model(高糖处理)、Anti-NC(转染inhibitor control后高糖处理)、Anti-miR-150-5p组(转染miR-150-5p inhibitor后高糖处理),Realtime PCR方法测定细胞中miR-150-5p表达,MTT方法测定细胞增殖变化,PI单染法检测细胞周期变化,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡变化,Western blot法检测细胞中C-Caspase-3、cyclinD1、p-AKT、p-PI3K蛋白表达。PI3K/AKT抑制剂LY294002处理转染miR-150-5p inhibitor后的足细胞,给予高糖处理,检测细胞增殖、周期和凋亡变化。结果:与Control组比较,Model组细胞中miR-150-5p表达水平升高,细胞增殖能力下降,细胞凋亡率升高,细胞G1期比例升高,细胞中C-Caspase-3蛋白表达水平升高,cyclinD1蛋白表达水平下降,p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K表达水平下降。与Anti-NC组比较,Anti-miR-150-5p组细胞中miR-150-5p表达水平降低,细胞增殖能力升高,细胞凋亡率降低,细胞G1期比例降低,细胞中C-Caspase-3蛋白表达水平降低,cyclinD1蛋白表达水平升高,p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K表达水平升高。PI3K/AKT抑制剂LY294002逆转miR-150-5p inhibitor对高糖条件下足细胞增殖、周期和凋亡影响。结论:下调miR-150-5p通过促进PI3K/AKT信号通路激活减少体外糖尿病肾病足细胞模型细胞凋亡。

足细胞凋亡在糖尿病肾病发病中的作用

糖尿病肾病是糖尿病患者最常见的慢性并发症之一,也是导致终末期肾衰竭的重要原因。近年研究发现,作为肾小球滤过屏障结构成分的足细胞在糖尿病肾病发生发展过程中起重要作用。多种因素如糖脂毒性、血管紧张素、糖基化终末产物等可引起足细胞的凋亡,促使糖尿病肾病的发生。

氧化应激在糖尿病肾病足细胞凋亡中的作用

氧化应激在抗肾小球基底膜滤过屏障中肾小球足细胞具有极其重要的作用,高血糖引起的氧化应激可经过多种途径参与足细胞的损伤。足细胞是一种终末分化细胞,损伤后病变不可逆转,因此在治疗足细胞损伤的最近研究中,预防足细胞的损伤尤为重要。对于阐明糖尿病肾病发病机制的研究中,氧化应激对于足细胞的损伤变成新的研究方向,为疾病的防治开辟全新的思路,也为糖尿病肾病患者的病理生理机制研究和早期防治带来新展望。

MiR‐873‐5p靶向HNRNPK调控糖尿病肾病足细胞的增殖和凋亡

目的探讨miR‐873‐5p对糖尿病肾病足细胞增殖和凋亡的影响以及作用机制。方法qRT‐PCR检测高糖培养的足细胞中miR‐873‐5p和HNRNPK相对表达水平。细胞增殖和凋亡实验分别采用CCK8和流式细胞仪检测。双荧光素酶实验检测miR‐873‐5p与核内不均一核糖核蛋白K(HNRNPK)之间的相互作用。Western blot实验检测高糖培养的足细胞中HNRNPK表达水平。结果高糖培养的足细胞中miR‐873‐5p相对表达水平显著高于正常培养的足细胞(P<0.05)。转染miR‐873‐5p inhibitor的高糖培养的足细胞增殖能力强于转染NC inhibitor的高糖培养的足细胞(P<0.05),而凋亡细胞比例却低于转染NC inhibitor的高糖培养的足细胞(P<0.05)。HNRNPK是miR‐873‐5p潜在靶点,在高糖培养的足细胞中HNRNPK表达水平与miR‐873‐5p表达呈负相关。转染si‐HNRNPK能显著降低足细胞中HNRNPK表达水平(P<0.05)。转染miR‐873‐5p inhibitor+si‐HNRNPK的高糖培养的足细胞增殖能力显著低于转染miR‐873‐5p inhibitor+si‐NC的高糖培养的足细胞(P<0.05),而凋亡细胞比例却高于于转染miR‐873‐5p inhibitor+si‐NC的高糖培养的足细胞(P<0.05)。结论MiR‐873‐5p在高糖培养的足细胞中高表达。干扰miR‐873‐5p表达通过靶向调节HNRNPK表达促进高糖培养的足细胞增殖和抑制凋亡。

疏利三焦法通过转化生长因子-β途径调节糖尿病肾病足细胞凋亡机制的研究

目的研究疏利三焦法通过转化生长因子-β(TGF-β)途径调节糖尿病肾病足细胞凋亡的机制。方法 48只SD大鼠,随机抽取8只作为对照组,余40只进行糖尿病肾病模型造模,取60 mg/kg的链脲佐菌素(STZ)溶解于0.1 mol/L灭菌枸橼酸钠缓冲液(pH 4.0)进行腹腔注射,对照组大鼠腹腔注射等量灭菌枸橼酸钠缓冲液。将34只造模成功大鼠随机分为模型组8只、缬沙坦组8只、疏利组9只、疏利高组9只。疏利组予三消汤9 mL/(kg·d)灌胃;疏利高组予三消汤18 mL/(kg·d)灌胃;缬沙坦组予缬沙坦10 mg/(kg·d)灌胃;对照组和模型组予0.9%氯化钠注射液18 mL/(kg·d)灌胃,连续给药8周。干预8周后,观察大鼠血糖、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量及肾脏TGF-β_1、Smad2/3蛋白、Smad7蛋白和足细胞凋亡水平。结果模型组、缬沙坦组、疏利组、疏利高组血糖、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量水平均高于对照组(P<0.05);缬沙坦组、疏利组、疏利高组肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量,疏利组、疏利高组血糖与模型组比较均降低(P<0.05);疏利组、疏利高组血糖、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量均低于缬沙坦组(P<0.05);疏利高组血糖、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量均低于疏利组(P<0.05)。模型组、缬沙坦组、疏利组、疏利高组TGF-β_1、Smad2/3蛋白、足细胞凋亡均高于对照组(P<0.05),Smad7蛋白低于对照组(P<0.05);缬沙坦组、疏利组、疏利高组TGF-β_1、Smad2/3蛋白、足细胞凋亡均低于模型组(P<0.05),Smad7蛋白高于模型组(P<0.05);疏利组、疏利高组TGF-β_1、Smad2/3蛋白、足细胞凋亡均低于缬沙坦组(P<0.05),Smad7蛋白高于缬沙坦组(P<0.05);疏利高组TGF-β_1、Smad2/3蛋白、足细胞凋亡低于疏利组(P<0.05),Smad7蛋白高于疏利组(P<0.05)。结论疏利三焦法可通过抑制TGF-β/Smad信号通路激活,进而抑制足细胞凋亡,缓解糖尿病肾病病情,值得进一步研究探讨。

细胞自噬与糖尿病肾病关系的研究进展

目前对于糖尿病肾病(DN)发病机制仍不明确。自噬是真核生物中一种普遍存在的生命现象,其主要功能是通过分解和再利用细胞内的蛋白质以及移除受损的细胞器,以维持细胞内环境的稳态。近期研究显示,自噬在DN发病中具有关键影响。现就自噬在DN中的研究现状进行综述,并对其在DN防治中的作用进行探讨,以期为广泛靶向治疗选择和为临床实践提供更坚实理论基础。

基于“通肾络、益脾肾”治法研究足细胞凋亡及自噬

[目的]基于中医"通肾络、益脾肾"治法,探讨通络益肾方对体外高糖培养的小鼠肾小球足细胞自噬和凋亡蛋白SIRT1、BNIP3、P62、Bax表达的调控影响。[方法]成熟无特定病原体(SPF)级SD雄性大鼠40只,随机分为正常组、中药高、中、低剂量组各10只。按照人与大鼠体表面积折算方法计算出大鼠所需中药灌胃浓度:高剂量浓度4.76 g/mL、中剂量浓度2.38 g/mL、低剂量浓度1.19 g/m L,灌胃10 d取含药血清备用。足细胞分6组,正常组5.6 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清、高糖组30mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清、通络益肾方含药血清高、中、低干预组30 mmol/L葡萄糖+10%高、中、低剂量大鼠血清、高渗组甘露醇24.5 mmol/L+10%正常大鼠血清。细胞培养48 h后收集,Hoechst33342荧光染色,观察各组足细胞凋亡状况及形态变化;流式细胞仪检测足细胞凋亡率;Western Blot检测细胞内自噬标志蛋白SIRT1、P62及促凋亡蛋白BNIP3、Bax表达水平。[结果]流式细胞仪检测结果显示通络益肾方中、低剂量组可降低高糖诱导的足细胞凋亡率(P<0.01或P<0.05),高剂量组不能改善凋亡情况(P>0.05);Hoechst33342荧光染色观察结果也证实通络益肾方中、低剂量组可降低高糖诱导的足细胞凋亡率;蛋白印迹结果显示,与高糖组相比,通络益肾方中、低剂量组自噬标志蛋白SIRT1表达升高,自噬标志蛋白P62及促凋亡蛋白BNIP3、Bax蛋白表达下降(P<0.05或P<0.01),高剂量组SIRT1、BNIP3、P62、Bax蛋白表达未见明显改变(P>0.05)。[结论]中剂量、低剂量通络益肾方能够启动细胞自噬减少高糖刺激下体外培养足细胞凋亡,降低细胞凋亡率及凋亡蛋白的表达。

IQGAP1在2型糖尿病肾病患者足细胞凋亡中的作用探究

目的探讨IQ结构域GTP酶活化蛋白1(IQGAP1)在2型糖尿病肾病患者足细胞凋亡中的作用及机制探究。方法采用免疫组织化学法完成两组肾脏组织中IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2表达水平;采用SPSSPearson相关性分析软件分析IQGAP1与p-ERK1/2、ERK1/2表达及分布关系。结果实验组糖尿病肾病组织中IQGAP1阳性率低于对照组(P<0.05);实验组糖尿病肾病组织中p-ERK1/2、ERK1/2阳性率均高于对照组(P<0.05);免疫组化结果表明:实验组糖尿病肾病组织中足细胞裂隙变窄,足突缩小及伴有节段性融合,可见足细胞凋亡小体形成,IQGAP1分布在肾小球足细胞、系膜细胞、血管内皮细胞中;对照组肾脏组织中未见肾脏病变改变,IQGAP1表达水平较高;SPSSPearson相关性分析结果表明:实验组肾脏组织中IQGAP1与p-ERK1/2、ERK1/2蛋白阳性率呈正相关性(P<0.05)。结论IQGAP1在2型糖尿病肾病患者中呈低表达,且表达水平与p-ERK1/2、ERK1/2存在相关性,可能由于p-ERK1/2、ERK1/2能引起足细胞凋亡,从而引起大量蛋白尿,导致糖尿病肾病的发生。

雷帕霉素对高糖诱导的人肾小球足细胞增殖、凋亡和IL-6表达的影响及其机制

目的观察雷帕霉素对高糖诱导的人肾小球足细胞增殖、凋亡和IL-6表达的影响,并基于磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(AKT)信号通路探讨相关机制。方法体外培养人肾小球足细胞系HGPC,分为对照组、高糖组、实验组,对照组不做干预,高糖组、实验组加入30 mmol/L D-葡萄糖,实验组在此基础上分别加入2.5、5、10μmol/L雷帕霉素,检测各组细胞活力,筛选雷帕霉素最适浓度。将HGPC细胞分为对照组、高糖组、实验组、抑制剂组、雷帕霉素+抑制剂组、雷帕霉素+激动剂组;对照组不加药物,高糖组加入30 mmol/L D-葡萄糖,抑制剂组加入30 mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002,实验组、雷帕霉素+抑制剂组、雷帕霉素+激动剂组加入30 mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L雷帕霉素,雷帕霉素+抑制剂组再加入10μmol/L LY294002,雷帕霉素+激动剂组再加入10μmol/L PI3K/AKT信号通路激动剂SC79;各组给药后培养24 h。采用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷法检测细胞增殖能力,Hoechst 33258染色检测凋亡细胞;采用ELISA法检测细胞培养液上清中的白细胞介素6(IL-6);Western blotting法检测细胞中的细胞周期素D1(Cyclin D1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)及PI3K/AKT通路相关蛋白。结果高糖组细胞增殖率、Cyclin D1表达低于对照组,实验组和抑制剂组细胞增殖率、Cyclin D1表达高于高糖组;与实验组相比,雷帕霉素+抑制剂组细胞增殖率、Cyclin D1表达增高,雷帕霉素+激动剂组细胞增殖率、Cyclin D1表达降低(P均<0.05)。高糖组细胞凋亡率、Caspase-3表达及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、IL-6水平高于对照组,实验组和抑制剂组细胞凋亡率、Caspase-3表达及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、IL-6水平低于高糖组;与实验组相比,雷帕霉素+抑制剂组细胞凋亡率、Caspase-3表达及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、IL-6水平下降,雷帕霉素+激动剂组凋亡率、Caspase-3表达及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、IL-6水平上升(P均<0.05)。结论雷帕霉素可促进高糖诱导的人肾小球足细胞增殖,减少细胞凋亡,减轻炎症损伤,其机制可能与抑制PI3K/AKT通路有关。

蛋白质非酶糖基化终产物对足细胞自噬与凋亡的影响

目的:探讨蛋白质非酶糖基化终产物(AGEs)作用下人足细胞自噬和凋亡发生情况及可能的信号转导通路。方法:体外培养永生化人足细胞,以AGEs 100 mg/L分别不同时间(0、4、8、12、24 h)刺激足细胞。Western blotting检测足细胞自噬标记性蛋白微管相关蛋白1B轻链3-II/I(LC3-II/I)、自噬相关基因Atg5、哺乳动物雷帕霉素靶点受体(m TOR)信号通路相关蛋白p70 S6激酶1(p-p70 S6 Kinase,p70 S6Kinase)表达水平;荧光显微镜观察自噬溶酶体形成标志蛋白溶酶体膜蛋白(LAMP2a);AnnexinⅤ/7-AAD双染流式细胞术检测足细胞早期和晚期凋亡。结果:(1)与0 h相比,100 mg/L AGEs刺激后足细胞LC3BII/I表达水平在4、8、12、24 h均明显下降(P<0.05);Atg5蛋白表达水平在8、12、24 h均明显下降(P<0.05),在12 h下降达到最高峰;p-p70 S6 Kinase水平在4、8、12 h升高(P<0.05),在12 h达峰,在24 h再次下降;(2)免疫荧光染色结果显示,与0 h相比,100 mg/L AGEs刺激足细胞12 h LAMP2a表达明显减少;(3)与0 h相比,100 mg/L AGEs刺激后足细胞发生早期凋亡+晚期凋亡比例在4、8、12、24 h逐渐增加(P<0.05),在12 h达峰(14.07%)。结论:AGEs刺激下人足细胞自噬减少,凋亡增加,伴随着m TOR/p70S6 Kinase信号通路激活。AGEs可能通过m TOR/p70 S6 Kinase信号通路途径调节足细胞自噬与凋亡,从而导致足细胞损伤。

基于AKAP1/Drp1信号通路探讨当归补血汤对糖尿病肾病大鼠足细胞线粒体分裂及凋亡的影响

目的:观察当归补血汤对糖尿病肾病(DKD)大鼠足细胞线粒体分裂及凋亡的影响,探讨当归补血汤对DKD大鼠肾脏保护作用及机制。方法:SD大鼠随机分为造模组65只,喂养高糖高脂饲料;正常组10只,喂养普通饲料;6周后,造模组大鼠予腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备2型糖尿病(T2DM)模型。将制备成功的T2DM大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组(0.014 g·kg^(-1))、当归补血汤低、中、高剂量组(0.36、0.72、1.44 g·kg^(-1))。连续灌胃16周。治疗第16周末检测各组大鼠空腹血糖(FBG)、24 h尿蛋白(24 h UTP);苏木素-伊红(HE)、马松(Masson)染色观察大鼠肾组织病理;透射电镜(TEM)观察足细胞线粒体;二氢乙锭(DHE)法检测大鼠肾组织活性氧簇(ROS)表达水平;原位末端标记法(TUNEL)检测各组大鼠肾细胞凋亡情况;免疫组化法(IHC)检测大鼠肾组织中足细胞标志蛋白突触足蛋白(Synaptopodin)、膜蛋白(Podocin)及切割型胱天蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肾组织激酶锚定蛋白1(AKAP1)、磷酸化动力相关蛋白1(p-Drp1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠FBG、24 h UTP表达升高;可见肾小球内系膜增生,基底膜增厚;电镜下足细胞线粒体肿胀,线粒体嵴断裂、紊乱;ROS表达增加,TUNEL阳性细胞明显增多,Synaptopodin、Podocin表达降低,cleaved Caspase-3表达增加,AKAP1、p-Drp1表达增加,Mfn2、Bcl-2/Bax表达降低(P<0.01);与模型组比较,当归补血汤高剂量组能降低FBG、24 h UTP水平,肾组织病理损伤及足细胞线粒体损伤明显改善,ROS表达减少,肾组织TUNEL阳性细胞数明显减少,Synaptopodin、Podocin表达升高,cleaved Caspase-3表达降低,AKAP1、p-Drp1表达降低,Mfn2、Bcl-2/Bax表达增加(P<0.05,P<0.01)。结论:当归补血汤可通过调控AKAP1/Drp1通路抑制足细胞线粒体分裂及凋亡,减少蛋白尿,从而延缓DKD进展。

基于PERK/ATF4/CHOP途径探讨当归补血汤含药血清抑制糖尿病肾病内质网应激改善足细胞凋亡的机制

目的:观察当归补血汤对高糖刺激小鼠永生化足细胞MPC5内质网应激通路蛋白激酶样内质网激酶(PERK)/活化转录因子4(ATF4)/CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、切割型胱天蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)的影响,通过体外研究阐明当归补血汤调控糖尿病肾病(DKD)足细胞凋亡的具体机制及靶点。方法:制备好含药血清、筛选好最适干预浓度后,将小鼠永生化足细胞MPC5分为5组:正常组(NG)、高糖组(HG)、空白血清组(KB)、当归补血汤含药血清组(DBT)、ERS抑制剂组(4-PBA)。NG组中足细胞用含5.5 mmol·L^(-1)葡萄糖的完全培养基培养;HG组中足细胞用含30 mmol·L^(-1)葡萄糖的完全培养基培养;KB组即HG组+10%空白血清;DBT组即HG组+10%当归补血汤含药血清;4-PBA组即HG组+4-PBA(2.5 mmol·L^(-1))。各组予对应药物进行干预刺激,作用48 h,然后将细胞收集。原位末端标记法(TUNEL)测细胞DNA损伤,免疫荧光检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、磷酸化(p)-PERK、ATF4、CHOP、足细胞膜蛋白(Podocin)、突触足蛋白(Synaptopodin)表达,同时提取足细胞蛋白,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测GRP78、PERK、p-PERK、真核翻译起始因子2α(eIF2α)、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达。结果:与正常组比较,高糖组GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP荧光强度显著增加,Podocin、Synaptopodin荧光强度减弱,足细胞TUNEL荧光阳性细胞核明显增多,GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达显著上升,Bcl-2表达显著下降(P<0.01)。与高糖组比较,当归补血汤含药血清组及ERS抑制剂组GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP的荧光强度明显减弱,Podocin、Synaptopodin荧光表达增强,TUNEL阳性染色细胞核的数量明显减少,细胞核损伤减轻,GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达显著下调,Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.01)。高糖组和空白血清组以上结果比较差异无统计学意义。结论:当归补血汤含药血清可通过拮抗PERK/ATF4/CHOP信号通路的活化实现对足细胞凋亡的抑制,保护足细胞。

糖尿病肾病足细胞损伤病理机制及信号通路的研究进展

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的微血管并发症,是终末期肾病的重要的病因之一。关于DN发病机制,最新研究发现,足细胞损伤在DN的病程中起到至关重要的作用,主要包括足细胞肥大、上皮间充质转化(EMT)、足细胞凋亡和足细胞自噬,且多个肾脏信号通路的破坏在这些病理损伤的进展中至关重要,例如腺苷单磷酸活化激酶信号通路(AMPK)、Wnt/β-catenin信号通路、内质网应激相关信号通路等。本文从糖尿病肾病足细胞损伤病理机制及信号通路的研究进展作为出发点,进一步了解分子机制方面糖尿病肾病足细胞损伤。

保肾通络方含药血清对高糖培养足细胞Nephrin、 Desmin蛋白表达及细胞凋亡的影响

目的:探讨保肾通络方含药血清对于高糖培养下足细胞肾病蛋白(Nephrin)、结蛋白(Desmin)表达及细胞凋亡的影响。方法:细胞实验分为正常对照组、模型组和保肾通络方低、中、高剂量组。正常对照组足细胞予DMEM低糖培养基培养,模型组和保肾通络方不同剂量组予含有30 mmol/L葡萄糖的高糖培养基培养。保肾通络方不同剂量组足细胞在高糖培养基中分别加入保肾通络方含药血清低、中、高剂量进行干预,正常对照组及模型组加入等剂量空白血清。CCK-8法检测足细胞的细胞活性,免疫荧光及RT-PCR检测足细胞Nephrin、Desmin蛋白及mRNA表达水平,免疫荧光检测足细胞凋亡相关蛋白Caspase-3蛋白表达,Hochest33258染色检测足细胞凋亡情况。结果:与正常对照组比较,模型组足细胞的细胞活性明显降低,Nephrin蛋白表达明显下调,Desmin、Caspase-3蛋白表达明显上调,足细胞凋亡细胞数目明显增加(均P<0.05)。与模型组比较,保肾通络方低、中、高剂量组足细胞的细胞活性明显升高,Nephrin蛋白表达明显上调,Desmin、Caspase-3蛋白表达明显下调,足细胞凋亡数目明显减少(均P<0.05)。结论:保肾通络方可能通过上调足细胞Nephrin蛋白表达,下调Desmin蛋白表达,抑制足细胞凋亡,进而减轻足细胞损伤。

巨噬细胞在糖尿病肾病足细胞凋亡中的作用

巨噬细胞是浸润糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的主要免疫细胞,其介导的炎症反应在DN的发生发展中起到不可或缺的作用。足细胞损伤在DN的病理机制中起关键作用,其中,足细胞凋亡是DN发生发展的中心事件。近年来不断有研究指出,巨噬细胞M1表型释放促炎细胞因子介导足细胞凋亡,而M2表型对足细胞起到保护作用,一定程度上有助于修复足细胞损伤,避免足细胞凋亡。本综述从DN中足细胞凋亡、DN与巨噬细胞、巨噬细胞调节足细胞凋亡的角度探讨DN的治疗新思路,发现抑制M1表型活化、促进M2表型转化可减少足细胞凋亡,靶向巨噬细胞疗法可能是抑制DN进展的新疗法。

低分子量肝素对糖尿病肾病足细胞损伤的影响及机制

目的探讨低分子量肝素(LMH)对糖尿病肾病(DN)足细胞损伤的影响及机制。方法将人肾小球足细胞(HGPC)分为对照(NC)组、高浓度葡萄糖(HG)组、1、5、10、15、20μmol/L LMH组,NC组细胞以含5 mmol/L葡萄糖的培养基培养;HG组细胞以含30 mmol/L的葡萄糖培养基培养;1、5、10、15、20μmol/L LMH组细胞以含30 mmol/L葡萄糖+不同浓度(1、5、10、15、20μmol/L)LMH的培养基共同培养,筛选出最佳浓度15μmol/L LMH后,又将细胞分为NC组、HG组、LMH组、BAY11-7082组、LMH+BAY11-7082组、LMH+Prostratin组。LMH组细胞以含30 mmol/L葡萄糖+15μmol/L LMH的培养基共同培养;BAY11-7082组细胞以含30 mmol/L的葡萄糖+1μmol/L BAY11-7082的培养基培养;LMH+BAY11-7082组细胞以含30 mmol/L葡萄糖+15μmol/L LMH+1μmol/L BAY11-7082的培养基培养;LMH+Prostratin组细胞以含30 mmol/L葡萄糖+15μmol/L LMH+20μmol/L Prostratin的培养基培养。采用活细胞计数法(CCK-8)检测HGPC细胞的细胞活力;Hoechst 33258染色法检测HGPC细胞的凋亡状况;Transwell小室实验检测HGPC细胞的侵袭能力;酶联免疫吸附实验检测HGPC裂解液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6表达;蛋白免疫印迹法检测HGPC细胞中核转录因子kappa-B(NF-κB)p65、磷酸化(p)-NF-κBp65、波形蛋白(Vimentin)、纤连蛋白(FN)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)表达。结果CCK-8结果显示,LMH的最适浓度为15μmol/L。药物处理24 h后,与NC组相比,HG组细胞凋亡率、侵袭细胞数升高(P均<0.05);与HG组相比,LMH组和BAY11-7082组细胞凋亡率、侵袭细胞数下降(P均<0.05);与LMH组相比,LMH+BAY11-7082组细胞凋亡率、侵袭细胞数下降(P均<0.05),LMH+Prostratin组细胞凋亡率、侵袭细胞数升高(P均<0.05)。与NC组相比,HG组TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65、Vimentin、FN、N-cadherin蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达降低(P均<0.05);与HG组相比,LMH组和BAY11-7082组TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65、Vimentin、FN、N-cadherin蛋白表达下降,而E-cadherin蛋白表达上调(P均<0.05);与LMH组相比,LMH+BAY11-7082组TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65、Vimentin、FN、N-cadherin蛋白表达下降(P均<0.05),而E-cadherin蛋白表达上调(P均<0.05);LMH+Prostratin组TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65、Vimentin、FN、N-cadherin蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达降低(P均<0.05)。结论LMH可抑制HG诱导的DN足细胞损伤,其机制可能是抑制NF-κB信号通路的活性和EMT进程。