基于PARP1信号通路研究芒柄花素对糖氧剥夺/复氧复糖神经元细胞损伤的影响

目的 基于PARP1信号通路研究芒柄花素对糖氧剥夺/复氧复糖神经元细胞损伤的影响,为揭示运用锦鸡儿异黄酮治疗脑缺血再灌注损伤提供理论依据。方法 建立小鼠神经元细胞(HT22)糖氧剥夺/复氧复糖(OGD/R)模型,通过Western blot检测糖氧剥夺/复氧复糖不同时间HT22神经元细胞中PARP1和PARG表达情况,选择通路变化最佳时间点。分别使用芒柄花素、PARP1抑制剂(PJ34)和PARG抑制剂处理OGD/R后的HT22细胞,设置6个组,分别为对照组、对照组+芒柄花素组、OGD/R组、OGD/R+芒柄花素组、OGD/R+PJ34组、OGD/R+PARG抑制剂组。对照组HT22细胞正常培养,不进行OGD/R处理;采用免疫荧光、Western blot法检测各组细胞凋亡因子、相关蛋白表达水平。结果 在糖氧剥夺/复氧复糖3 h后,HT22细胞中PARP1通路激活最明显,在OGD/R 3 h条件下,芒柄花素、PJ34或PARG抑制剂处理后可提高E3泛素连接酶(Iduna),抑制PARP1、PARG通路蛋白表达,并降低AIF和P53表达,提高AKT蛋白磷酸化水平。结论 HT22小鼠神经元细胞在OGD/R条件下,芒柄花素可通过提高Iduna蛋白表达抑制PARP1/AIF/Akt信号通路减轻HT22小鼠神经元细胞损伤。

咪达唑仑减轻氧糖剥夺/复糖复氧诱导的小鼠神经元损伤

目的 探讨咪达唑仑对氧糖剥夺(OGD)/复糖复氧(R)诱导的小鼠神经元细胞系HT22损伤的影响。方法 用OGD/R诱导建立神经元细胞HT22损伤模型,将HT22细胞分为OGD/R组、咪达唑仑低、中和高剂量组、咪达唑仑高剂量+KG-501(CREB抑制剂)组,另设常规培养HT22细胞为对照组。ELISA检测TNF-α、IL-6水平;商品化试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA);MTT和Edu实验检测细胞增殖;流式细胞术测量细胞凋亡率;RT-qPCR检测CREB mRNA和PGC-1α mRNA表达水平;Western blot检测Ki-67、Bcl-2、Bax、CREB、PGC-1α蛋白表达水平。结果 与对照组相比,OGD/R组细胞A490值(24、48 h),增殖率、SOD、CAT活性、CREB mRNA和PGC-1α mRNA表达水平、Ki-67、Bcl-2、CREB、PGC-1α蛋白表达水平显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、TNF-α、IL-6、MDA、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)。与OGD/R组相比,咪达唑仑低、中、高剂量组细胞A490值(24、48 h),增殖率、SOD、CAT活性、CREB mRNA和PGC-1α mRNA表达水平、Ki-67、Bcl-2、CREB、PGC-1α蛋白表达水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率、TNF-α、IL-6、MDA、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)。与咪达唑仑高剂量组相比,咪达唑仑高剂量+KG-501组A490值(24、48h),增殖率、SOD、CAT活性、CREB mRNA和PGC-1α mRNA表达水平、Ki-67、Bcl-2、CREB、PGC-1α蛋白表达水平显著降低,凋亡率、TNF-α、IL-6、MDA水平、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05),差异具有统计学意义。结论 咪达唑仑可促进OGD/R诱导的HT22细胞增殖,降低细胞凋亡从而减轻神经细胞损伤。

丹参酮IIA上调Nrf2/HO-1信号通路减轻海马神经元氧糖剥夺/复糖复氧损伤

目的:探讨丹参酮IIA(Tan IIA)对海马神经元氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤以及核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法:体外培养并取对数生长期小鼠海马神经元HT22细胞开展实验,设对照(Control)组、模型(OGD/R)组、Tan IIA(5μg/ml)组、Nrf2激动剂叔丁基对苯二酚(TBHQ,1.6μg/ml)组和Tan IIA(5μg/ml)+TBHQ(1.6μg/ml)组。各组分别给药干预2h后,除Control组外,其它组通过氧糖剥夺6h后复糖复氧24h构建HT22细胞OGD/R损伤模型。MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)探针法检测细胞中活性氧(ROS)含量,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化法、钼酸铵法检测超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western Blotting检测Nrf2/HO-1信号通路相关mRNA和蛋白表达。结果:与OGD/R组相比,Tan IIA组、TBHQ组和Tan IIA+TBHQ组HT22细胞活力明显升高、凋亡率明显降低(P<0.05);细胞中ROS、MDA含量明显降低,SOD、CAT活性明显升高(P<0.05);Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达量明显升高,B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)蛋白表达量明显升高,Bcl-2相关X蛋白(Bax)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达量及Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值明显降低(P<0.05)。Tan IIA+TBHQ组对各检测指标的调控作用明显优于Tan IIA组和BHQ组(P<0.05)。结论:Tan IIA对OGD/R损伤海马神经元氧化应激损伤和凋亡具有抑制作用,其机制可能与上调Nrf2/HO-1信号通路有关。

lncRNA BDNF-AS在氧糖剥夺/复氧复糖条件下的表达、定位及互作蛋白质分析

脑缺血缺氧会引起长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)表达变化。为了探究lncRNA BDNF-AS在氧糖剥夺/复氧复糖条件下的表达、定位及互作蛋白质,将SH-SY5Y细胞缺氧缺糖8 h、复氧复糖24 h,构建氧糖剥夺/复氧复糖细胞模型;采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测细胞活力;采用qRT-PCR检测核质中lncRNA BDNF-AS表达水平;利用pull-down和质谱技术对lncRNA BDNF-AS互作蛋白质进行鉴定;利用基因本体论(Gene Ontology,GO)、京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析互作蛋白质的功能及参与的通路;利用STRING数据库分析蛋白质-蛋白质相互作用网络。结果显示:氧糖剥夺/复氧复糖条件下,lncRNA BDNF-AS表达量显著升高,且胞质表达量显著高于胞核;氧糖剥夺/复氧复糖组有120种蛋白质可能与lncRNA BDNF-AS存在潜在的相互作用。进一步的生物信息学分析表明,lncRNA-BDNF-AS可能与UBA52、NKAP、TBK1、RAB1A、RPL38等蛋白质存在互作关系。综上可知,lncRNA BDNF-AS可能通过绑定自噬和凋亡相关蛋白质影响神经细胞功能。

微小RNA-124促进氧糖剥夺/复糖复氧后脑微血管内皮细胞血管新生的研究

目的探讨微小RNA(miR)-124对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)后脑微血管内皮细胞(BMEC)血管新生的作用及相关机制。方法将小鼠BMEC随机分为6组,正常对照组(con组),OGD/R组,OGD/R+过表达对照组(OGD/R+ov-con组),OGD/R+miR-124过表达组(OGD/R+ov-miR-124组),OGD/R+沉默对照组(OGD/R+si-con组),OGD/R+miR-124沉默组(OGD/R+si-miR-124组)。比较各组BMEC迁移距离、BMEC迁移数量、小管形成数量、CD31阳性细胞数、miR-124水平、15脂氧化酶(15-LOX)mRNA及蛋白表达水平。结果与con组比较,OGD/R组BMEC迁移距离、BMEC迁移数量、小管形成数量及miR-124水平降低(P<0.05,P<0.01);OGD/R组15-LOXmRNA及蛋白表达水平较con组显著升高(3.29±0.24vs1.00±0.00,4.31±0.39vs1.00±0.00,P<0.01)。与OGD/R+ov-con组比较,OGD/R+ov-miR-124组BMEC迁移距离、BMEC迁移数量、小管形成数量、CD31阳性细胞数、miR-124水平明显升高,15-LOXmRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05);与OGD/R+si-con组比较,OGD/R+si-miR-124组BMEC迁移距离、BMEC迁移数量、小管形成数量、CD31阳性细胞数、miR-124水平降低,15-LOXmRNA及蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论miR-124可能通过调控15-LOX水平促进OGD/R后BMEC血管新生,为缺血性脑卒中提供潜在治疗靶点。

二氢丹参酮Ⅰ对氧糖剥夺/复氧复糖诱导H9c2细胞损伤的影响及作用机制研究

目的观察二氢丹参酮Ⅰ(DHT)对氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)诱导的大鼠心肌细胞H9c2损伤的影响,探讨其保护心肌的作用机制。方法将H9c2细胞分为对照组、模型组和DHT组,CCK-8法检测细胞活力,转录组测序对差异表达基因进行分析,绘制Venn图、热图,并进行聚类分析;应用KEGG数据库对差异基因进行GO和KEGG通路富集分析,并通过RT-qPCR和Western blot验证差异基因表达。结果CCK-8检测结果显示,与对照组比较,模型组H9c2细胞活力显著降低(P<0.01);与模型组比较,DHT组H9c2细胞活力显著升高(P<0.01)。组间差异基因分析结果显示,对照组与模型组差异基因有170个上调、426个下调,对照组和DHT组差异基因有345个上调、775个下调,模型组和DHT组差异基因有3个上调、14个下调。差异基因富集分析结果显示,DHT对OGD/R诱导的H9c2细胞损伤的保护的信号通路有乙型肝炎、坏死性凋亡、病毒致癌、人T细胞白血病病毒1感染、戊糖磷酸途径、酒精中毒、中性粒细胞外陷阱形成、C型凝集素受体信号通路、系统性红斑狼疮。验证结果显示,与对照组比较,模型组细胞EGR2、Junb、rpl13、Trir基因表达显著降低(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,DHT组细胞EMC6、rpl13、Trir基因表达显著升高(P<0.01),EGR2、Junb基因表达有升高趋势,与转录组测序分析结果一致。同时,DHT可以上调EGR2、Junb、rpl13蛋白表达。结论DHT对OGD/R诱导的H9c2细胞损伤具有一定保护作用,其作用机制可能与上调EGR2、EMC6、Junb、rpl13和Trir表达有关。

芹菜素对化学法氧糖剥夺/复氧复糖损伤大鼠心肌细胞保护作用研究

目的:研究芹菜素(API)对化学法氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)大鼠H9c2心肌细胞损伤的保护作用及分子机制。方法:首先给予H9c2细胞不同浓度的氯化钴(CoCl_(2))或1%O2处理24 h,通过测定细胞活力和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达水平,确定模拟1%O2的等效CoCl_(2)浓度;然后给予H9c2细胞CoCl_(2)或1%O_(2)处理合并无糖培养16 h,再正常培养(复氧复糖)4 h,测定细胞活力和HIF-1α的表达水平,确定OGD/R模型等效CoCl_(2)浓度。MTT法测定不同浓度API对OGD/R大鼠H9c2细胞活力的影响;ELISA法检测细胞Caspase-3含量;超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞SOD和LDH含量;采用Western印迹方法检测细胞Bcl-2、Bax、SIRT1、p62和LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平。结果:筛选1%O_(2)的等效CoCl_(2)浓度结果显示,与对照组相比,CoCl_(2)(0.8 mmol/L)组细胞活力明显降低(P<0.05),HIF-1α表达明显上调(P<0.05)且与1%O_(2)组无显著差异(P>0.05),因此选取CoCl_(2)(0.8 mmol/L)用于OGD/R模型。与对照组相比,OGD/R组的细胞活力及SOD含量明显下降(P<0.05),LDH漏出量和Caspase-3含量明显提高(P<0.05),SIRT1、LC3Ⅱ/Ⅰ及Bcl-2表达量均明显下降(均P<0.05),Bax及p62的表达量明显增加(P<0.05);与OGD/R组相比,API(0.01~10μmol/L)组细胞活力有显著提高(P<0.05);10μmmol/L API能显著提高细胞SOD含量(P<0.05),显著降低LDH漏出量和Caspase-3含量(均P<0.05),明显提高SIRT1、LC3Ⅱ/Ⅰ及Bcl-2的表达量(均P<0.05),降低Bax及p62的表达量(均P<0.05)。结论:0.8 mmol/L CoCl_(2)合并剥糖16 h后恢复4 h可构建稳定的H9c2细胞OGD/R损伤模型,API可通过调节SIRT1增强自噬以抵抗H9c2细胞OGD/R损伤和凋亡。

雷公藤甲素通过抑制NogoA/RhoA/ROCK信号通路减轻氧糖剥夺/复糖复氧所致的SH-SY5Y细胞损伤

目的基于Nogo-A/RhoA/ROCK信号通路探讨雷公藤甲素减轻氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的机制。方法CCK8法检测不同浓度雷公藤甲素对正常SH-SY5Y细胞活性的影响以筛选最佳的药物作用浓度;然后将SH-SY5Y细胞分为4组:正常对照组、模型组、雷公藤甲素(1 nmol/L)干预组、Rho激酶抑制剂法舒地尔(15μg/mL)干预组。CCK8法检测SH-SY5Y细胞活性;JC-1试剂盒评估线粒体膜电位;免疫荧光染色检测NogoA、ROCK2和GAP43的表达;Western blot法检测GAP43、PSD95、NogoA、NgR、RhoA和ROCK2的表达。结果CCK8结果显示,雷公藤甲素的最适作用浓度为1 nmol/L。与正常对照组比较,模型组细胞活性降低(P<0.001);线粒体膜电位下调(P<0.001);GAP43和PSD95表达降低(P<0.001);同时NogoA、NgR、RhoA和ROCK2表达增加(P<0.001);雷公藤甲素干预和法舒地尔干预均可以改善OGD/R诱导的细胞损伤,使细胞活性增加(P<0.001),线粒体膜电位上升(P<0.001);上调GAP43和PSD95表达(P<0.05);同时下调NogoA、NgR、RhoA和ROCK2的表达(P<0.001)。结论雷公藤甲素可以通过抑制NogoA/RhoA/ROCK信号通路减轻OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤。

二甲双胍通过Wnt/β-catenin信号通路对U251细胞氧糖剥夺/复糖复氧损伤的作用机制研究

目的探讨二甲双胍对U251细胞氧糖剥夺/复糖复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤的作用机制。方法用OGD/R后的U251细胞模型来模拟人脑缺血再灌注损伤。将U251细胞分为6组,即空白对照组、模型组、二甲双胍中剂量组、二甲双胍高剂量组、激动剂组(Wnt3a,Wnt/β-catenin信号通路激动剂)、抑制剂组(二甲双胍+XAV939,Wnt/β-catenin信号通路抑制剂)。除空白对照组外,其余各组细胞均予以氧糖剥夺/复糖复氧2h后再灌注24h处理,建立OGD/R模型,造模前24h动物均予以二甲双胍、Wnt3a和XAV939处理。采用CCK-8法和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)实验检测细胞活力和毒性,DHE染色检测细胞ROS形成情况,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)检测细胞中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,Western blot法检测细胞β-catenin、cyclin D1、p-GSK-3β(Ser9)及GSK-3β蛋白表达水平。结果与空白对照组比较,模型组、二甲双胍组、激动剂组及抑制剂组的LDH、ROS、MDA、IL-6、iNOS和TNF-α水平明显升高,SOD、GSH-Px、β-catenin、cyclin D1、p-GSK-3β(Ser9)蛋白相对表达量和细胞活力明显下降。与模型组比较,二甲双胍组、激动剂组的LDH、ROS、MDA、IL-6、iNOS和TNF-α水平明显下降,SOD、GSH-Px、β-catenin、cyclin D1、p-GSK-3β(Ser9)蛋白相对表达量和细胞活力明显升高。与二甲双胍组比较,抑制剂组的LDH、ROS、MDA、IL-6、iNOS和TNF-α水平明显升高,SOD、GSH-Px、β-catenin、cyclin D1、p-GSK-3β(Ser9)蛋白相对表达量和细胞活力明显下降。结论二甲双胍通过Wnt/β-catenin信号通路对OGD/R的U251细胞炎症和氧化应激,从而发挥神经保护作用。

梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤成熟人神经母细胞瘤细胞的修复作用及其机制

目的观察梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(SH-SY5Y细胞)的修复作用,并探讨其作用机制。方法将SH-SY5Y细胞分为对照组、诱导组、模型组、梓醇组。对照组:SH-SY5Y细胞不做任何处理;诱导组:用ATRA诱导SH-SY5Y细胞72 h,将其诱导为成熟神经元;模型组:ATRA诱导SH-SY5Y细胞72 h后,将完全培养基换成无糖的EBSS溶液置于三气培养箱(氧气1%,二氧化碳5%,氮气94%)4 h,氧糖剥夺结束后换回完全培养基(含糖),复氧12 h;梓醇组:细胞经模型组同样处理后,加入含不同浓度梓醇(50、100、200μmol/L)的完全培养基常规培养72 h。采用CCK-8法检测各组细胞的活力;细胞划痕实验观察细胞的迁移、穿越能力;β-Ⅲ-tubulin免疫荧光染色标记轴突,并测量其长度;Western blotting法检测细胞中神经生长相关蛋白(GAP43)、骨桥蛋白(OPN)、磷酸化的胰岛素生长因子1受体(p-IGFR)、抑癌基因(PTEN)、雷帕霉素分子靶点(mTOR)、磷酸化核糖体S6蛋白(p-S6)。结果与对照组相比,诱导组存活率升高(P<0.0001);与诱导组相比,模型组存活率降低(P<0.0001);不同浓度梓醇组存活率均有升高(P均<0.05),各浓度组之间比较,P>0.05。对照组细胞胞体圆润,轴突较短,胞体与胞体之间几乎没有轴突连接;诱导组细胞轴突较长并且相互交织,形成神经网络;与诱导组相比,模型组数量减少,胞体扁平,轴突回缩;与模型组比较,梓醇组神经元数量增多,轴突长度获得一定的恢复;与空白对照组相比,诱导组轴突长度延长;与诱导组相比,模型组轴突长度缩短(P<0.001);不同浓度梓醇组神经元轴突长度均延长(P均<0.01),而不同浓度梓醇组之间比较,P>0.05。与模型组相比,不同浓度梓醇组48 h后的划痕面积均小(P均<0.05),不同浓度梓醇组之间比较,P>0.05。与诱导组比较,模型组PTEN相对表达量升高(P<0.05),OPN降低(P<0.05);与模型组比较,不同浓度梓醇组GAP43、OPN、p-IGFR、mTOR及p-S6蛋白相对表达量均升高,PTEN蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。结论梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤的SH-SY5Y细胞具有修复作用,其作用机制可能是通过上调OPN表达,诱导细胞表面IGFR受体磷酸化成为p-IGFR,进而激活mTOR通路,同时降低PTEN的表达以减轻其对mTOR通路的抑制作用,使细胞内在生长能力被充分启动,从而达到促进神经细胞迁移、轴突发芽和生长的作用。50、100、200μmol/L梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤的SH-SY5Y细胞修复作用相当。

氧化苦参碱对氧糖剥夺/复糖复氧损伤星形胶质细胞AMPK/mTOR途径及自噬的影响

目的探讨AMPK/mTOR通路调节的自噬在氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)抑制氧糖剥夺/复糖复氧(oxygen-glucose deprivation and reperfusion injury,OGD/R)对星形胶质细胞(astrocyte,AS)损伤中的作用。方法将分离纯化AS随机分为对照组(CON组)、模型组(OGD/R组)和OGD/R+OMT组(0.1、0.2、0.4 mmol·L^(-1))。MTT法检测细胞存活率;Hoechst 33342和Annexin V-FITC法检测细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量;Western blot法检测p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、Beclin 1、LC3B、p62和β-actin的表达。同时通过加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)探究自噬在OMT药效中作用。结果与CON组相比,OGD/R组细胞存活率明显降低(P<0.01),细胞凋亡率及细胞内ROS生成明显增加(P<0.01),p-AMPK/AMPK和LC3BⅡ/Ⅰ的比值及Beclin 1含量升高(P<0.01),p-mTOR/mTOR比值及p62含量降低(P<0.01)。与OGD/R组相比,OGD/R+OMT组细胞存活率明显升高(P<0.01),细胞凋亡率减少(P<0.01),细胞内ROS生成明显减低(P<0.01),p-AMPK/AMPK和LC3BⅡ/Ⅰ的比值降低(P<0.01),p-mTOR/mTOR比值及p62含量升高(P<0.01)。与OGD/R组相比,OGD/R+3-MA组细胞存活率明显提高(P<0.01),同时OGD/R+3-MA组存活率与OGD/R+OMT及OGD/R+OMT+3-MA组相比均有明显差异(P<0.01)。结论OMT对OGD/R诱导的AS具有保护作用,其中作用与抑制AMPK/mTOR信号通路及改善自噬有关。

巴利森苷A对氧糖剥夺/复糖复氧损伤的HT22细胞的保护作用

目的:探讨巴利森苷A(PA)对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤的HT22细胞的保护作用。方法:将HT22细胞随机分为6组,分别是空白组(Control组)、OGD/R组、依达拉奉(EDA)组、PA低剂量组(40μmol·L^(-1))、PA中剂量组(80μmol·L^(-1))、PA高剂量组(160μmol·L^(-1))。以连二亚硫酸钠(Na_(2)S_(2)O_(4))10 mmol·L^(-1)合并无糖DMEM培养基造成氧糖剥夺培养2 h,然后恢复为无血清高糖DMEM培养2 h作复糖复氧处理,以建立体外OGD/R模型。EDA和PA组自氧糖剥夺前24 h即加入相应药物的浓度,一直持续到复糖复氧结束。采用MTT比色法检测细胞存活率;乳酸脱氢酶(LDH)法测定细胞损伤率;采用试剂盒法检测超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性、丙二醛(MDA)含量及细胞内的活性氧(ROS)水平;Western blot法检测各组细胞缺氧诱导因子通路相关蛋白HIF-1α和VEGF的表达水平。结果:与Control组相比,OGD/R组细胞肿胀,簇状聚集,细胞存活率下降(P<0.01),细胞损伤率升高(P<0.01),内源性抗氧化酶SOD活性下降,GSH-PX活性下降(P<0.01),氧化应激产物MDA含量增加,ROS水平增加(P<0.01)。与OGD/R组相比,PA给药组细胞形态较好,分布均匀,可提高细胞存活率(P<0.01),降低细胞损伤率(P<0.01),可提高SOD活性及GSH-PX活性(P<0.05),降低MDA含量及ROS水平(P<0.01),促进缺氧后HIF-1α和VEGF的蛋白表达(P<0.01)。结论:PA对OGD/R损伤的HT22细胞的氧化应激具有保护作用,其作用和调控缺氧诱导因子通路有关。

黄芪甲苷通过抑制细胞凋亡减轻氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞损伤的研究

目的:探讨黄芪甲苷对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞损伤的保护作用及机制。方法:选取对数生长期PC12细胞,随机分为正常对照组(Control)、模型组(Model)、黄芪甲苷组(AST-Ⅳ)。Control组细胞正常培养;Model组和AST-Ⅳ组细胞在氧糖剥夺2 h后,复氧复糖24 h;AST-Ⅳ组细胞在复氧复糖的同时给予黄芪甲苷(100 mmol/L)处理。倒置显微镜观察细胞生长状态,MTS法检测细胞存活率,Western blot检测Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达。结果:与Control组相比,Model组细胞折光性差,突触减少,细胞肿胀聚集、脱落,存活率降低,Bcl-2表达减少,Bax、Caspase-3的表达增多(P<0.05)。与Model组比较,AST-Ⅳ组细胞生长状态好转,肿胀、聚集减少,存活率增高,Bax、Caspase-3的表达减少,Bcl-2表达增多(P<0.05)。结论:黄芪甲苷可通过抑制氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞的凋亡发挥保护作用。

低氧预适应对氧糖剥夺/复糖复氧损伤的BV2细胞的保护作用及对其NLRP3表达的影响

目的研究低氧预适应(HPC)对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤的BV2细胞的保护作用及对其NLRP3表达的影响。方法将BV2细胞分为4组,分别为常氧组,HPC组,HPC+OGD/R组和OGD/R组,用MTS法测定细胞活力,蛋白免疫印迹测定BV2细胞中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)蛋白的表达。结果与常氧组相比,OGD/R组的细胞活力明显降低(P<0.05)。给予1%O 2低氧2 h/复氧2 h的低氧预适应后,HPC+OGD/R组细胞活力明显高于其它HPC条件及OGD/R组的细胞活力(P<0.05),且HPC+OGD/R组NLRP3蛋白的表达显著低于OGD/R组(P<0.05)。结论低氧预适应可对氧糖剥夺/复糖复氧损伤的BV2细胞起到保护作用,其作用机制可能与其降低氧糖剥夺/复糖复氧损伤的BV2细胞NLRP3的表达水平有关。

黄芪甲苷调控自噬减轻氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞氧化应激损伤研究

目的观察黄芪甲苷对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞自噬和氧化应激的影响。方法将PC12细胞分为正常组、模型组(即氧糖剥夺/复氧复糖组)、黄芪甲苷组、自噬抑制剂+黄芪甲苷组。用CCK-8法检测细胞活性;ELISA法检测MDA含量、SOD和GSH-Px活性;透射电镜和MDC荧光染色检测自噬小体;Western blot检测Beclin1蛋白表达。结果与正常组相比,模型组细胞活性降低(P<0.05),MDA含量增多、SOD和GSH-Px活性下降(P<0.05),可见自噬小体,Beclin1表达增多(P<0.05);与模型组相比,黄芪甲苷组细胞活性升高(P<0.05),MDA含量减少、SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05),自噬小体数量增多(P<0.05),Beclin1表达增多(P<0.05);当给予自噬抑制剂处理时,自噬抑制剂在减轻自噬的同时,可明显拮抗黄芪甲苷的抗氧化作用。结论黄芪甲苷可通过上调自噬减轻氧糖剥夺/复氧复糖诱导的PC12细胞氧化应激损伤,发挥保护作用。

毛蕊异黄酮抑制氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞凋亡研究

目的研究毛蕊异黄酮对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响。方法将对数生长期PC12细胞随机分为4组:正常对照组(Control)、模型组(Model)、毛蕊异黄酮组(Calycosin,0.07μmol·L^-1)和尼莫地平组(Nimodipine,5.00μmol·L^-1,阳性对照药组)。用CCK-8检测细胞存活率;流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡率和凋亡指数;免疫荧光染色检测细胞Bax/Bcl-2比值;Western blot检测细胞凋亡蛋白caspase-3表达。结果与Control组相比,Model组细胞存活率明显降低(P<0.05),细胞凋亡率和凋亡指数明显升高(P<0.05),Bax/Bcl-2比值和caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.05);与Model组相比,Calycosin组和Nimodipine组细胞存活率均明显升高(P<0.05),细胞凋亡率和凋亡指数均明显降低(P<0.05),Bax/Bcl-2比值和caspase-3蛋白表达均明显降低(P<0.05),差异有统计学意义。结论毛蕊异黄酮可明显提高氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞存活率,抑制细胞凋亡,其作用机制与毛蕊异黄酮调控凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3表达有关。

七氟醚后处理对氧糖剥夺/复氧复糖诱导HT22细胞DNA损伤及SIRT1表达的影响

目的探讨七氟醚后处理对HT22细胞氧糖剥夺/复氧复糖后DNA损伤及沉默信息调节因子1(SIRT1)表达的影响。方法随机将对数生长期的HT22细胞分为7组:空白对照组(CON),氧糖剥夺/复氧复糖4 h组(OGD/R 4 h),氧糖剥夺/复氧复糖4 h+1%七氟醚后处理组(OGD/R 4 h+1%SEVO),氧糖剥夺/复氧复糖4 h+2%七氟醚后处理组(OGD/R 4 h+2%SEVO),氧糖剥夺/复氧复糖6 h组(OGD/R 6 h),氧糖剥夺/复氧复糖6 h+1%七氟醚后处理组(OGD/R 6 h+1%SEVO),氧糖剥夺/复氧复糖6 h+2%七氟醚后处理组(OGD/R 6 h+2%SEVO);实验后序部分只取前四组研究。MTT法检测细胞存活率,PI/Hoechst荧光双染检测细胞坏死及凋亡,TUNEL染色检测神经元凋亡,免疫荧光染色测定Cleaved-casepase3表达,免疫荧光染色检测8-OHdG以测定DNA损伤程度,Western blot测定SIRT1、Bcl-2及BAX的蛋白表达。结果前半部分实验结果中,与CON组比较,OGD/R 4 h及OGD/R 6 h组细胞存活率均降低(均P<0.01),凋亡细胞及坏死细胞占比升高;与对应OGD/R 4 h组比较,1%和2%七氟醚后处理的细胞存活率升高(均P<0.01),凋亡及坏死细胞数量占比降低;与对应OGD/R 6 h组比较,1%和2%七氟醚后处理的细胞存活率升高(均P<0.01),凋亡及坏死细胞占比降低。实验后半部分,与CON组比较,OGD/R 4 h组中TUNEL染色阳性细胞数增多,Cleaved-casepase3表达增加(P<0.01),8-OHdG含量增多(P<0.01),BAX蛋白表达上调(P<0.01),SIRT1、Bcl-2蛋白表达下调(均P<0.01);与OGD/R 4 h组比较,1%和2%七氟醚后处理的细胞TUNEL染色阳性细胞数减少,Cleaved-casepase3表达降低(均P<0.01),8-OHdG含量降低(均P<0.01),BAX蛋白表达下调(P<0.05,P<0.01),而SIRT1、Bcl-2蛋白表达上调(均P<0.01;P<0.05,P<0.01)。结论七氟醚后处理改善氧糖剥夺/复氧复糖诱导的HT22海马神经元DNA氧化损伤及凋亡,并上调SIRT1蛋白表达。

抑制转位蛋白在氧糖剥夺/复糖复氧模型中对BV-2细胞损伤和自噬的影响

目的观察转位蛋白TSPO对OGD/R致BV2小胶质细胞损伤的作用,并初步探究TSPO在该模型中的自噬机制。方法离体培养BV2小胶质细胞,将实验分为正常组、OGD/R组、OGD/R+小发夹RNA阴性对照组(OGD/R+NCshRNA)、OGD/R+TSPO小发夹RNA组(OGD/R+TSPOshRNA),细胞中TSPO mRNA和TSPO蛋白的表达量分别采用qRT-PCR、Western blot方法检测。为探讨TSPO在OGD/R中致BV2小胶质细胞损伤和自噬作用,采用CCK-8实验检测细胞活力、自由氧(ROS)检测细胞毒性,qRT-PCR检测各组自噬相关mRNA(p62 mRNA、LC3B mRNA、Beclin-1 mRNA)表达情况、Western blot检测各组中自噬相关蛋白(p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1)表达情况。结果与正常组对比,OGD/R组中细胞TSPO mRNA和蛋白表达明显增高,细胞生存率明显降低,细胞毒性明显升高,LC3B mRNA、Beclin-1 mRNA水平升高,p62 mRNA表达量明显下降,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白水平升高,p62蛋白表达明显下降,自噬水平被激活;与OGD/R组比较,OGD/R+NCshRNA组细胞活力、细胞毒性和自噬水平差异无统计学意义,而OGD/R+TSPOshRNA组细胞生存率明显增高,细胞毒性和自噬水平明显降低。结论抑制TSPO在OGD/R模型中对BV2小胶质细胞损伤有明显的保护作用,该机制可能与抑制自噬相关。

ZNRF2抑制自噬保护氧糖剥夺/复糖复氧致PC12细胞损伤

目的观察膜相关E3泛素连接酶ZNRF2对OGD/R致PC12细胞损伤的保护作用,并从自噬初步探究其机制。方法体外培养PC12细胞,将PC12细胞分为正常组、模型组,采用qRT-PCR、Western blot检测细胞中ZNRF2 mRNA和蛋白的表达。为了进一步探讨ZNRF2对OGD/R致PC12细胞损伤的作用,将细胞分为正常对照组、模型组、ZNRF2过表达慢病毒组、空载病毒组、ZNRF2小干扰RNA组、阴性对照组,采用MTT实验检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡率、Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白(LC3、p62、Beclin-1)表达改变。结果与正常组相比,模型组中细胞ZNRF2 mRNA和蛋白表达明显降低,细胞活力明显降低,细胞凋亡率明显升高,LC3II、Beclin-1蛋白水平升高,p62蛋白表达明显下降;与模型组相比,LV-ZNRF2组细胞活力增加,细胞凋亡率和自噬水平减少,siR-ZNRF2组细胞活力明显下降,细胞凋亡率和自噬水平明显上升。结论ZNRF2对OGD/R致PC12细胞损伤有明显保护作用,其机制可能与抑制自噬相关。

丹酚酸B、人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对氧糖剥夺/复氧复糖损伤星形胶质细胞的保护作用

目的探讨丹酚酸B(salvianolate acid B,Sal B)、人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1,Rg1)及三七皂苷R1(notoginsenoside R1,R1)对氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)损伤大鼠星形胶质细胞保护作用及其机制的影响。方法培养并鉴定原代大鼠星形胶质细胞,建立OGD/R损伤模型,分为对照组、模型组、Sal B、Rg1、R1给药组(10μmol·L^(-1))。CCK-8测定细胞活力;流式细胞术测定线粒体膜电位、ROS释放量和钙离子浓度;RT-PCR测定IGF1α、BDNF、NGF神经营养因子mRNA表达水平;免疫印迹法测定PI3K、AKT、STAT3蛋白磷酸化表达水平。结果OGD/R组细胞活力显著降低,ROS释放量及钙离子浓度增加,线粒体膜电位降低,p-STAT3,p-PI3K,p-AKT表达下降,Sal B、Rg1、R1显著提高受损细胞活力,不同程度的调节ROS释放量、钙离子浓度、线粒体膜电位,Sal B及Rg1增加p-STAT3,p-AKT的表达;OGD/R组BDNF、NGF mRNA表达明显降低,Sal B、Rg1、R1均可显著升高受损细胞BDNF mRNA的表达;Rg1可提高NGF mRNA表达;Sal B升高IGF1αmRNA表达。结论Sal B、Rg1、R1通过调节PI3K/AKT、STAT3信号通路降低OGD/R损伤后星形胶质细胞氧化应激反应,降低细胞内钙离子超载发挥星形胶质细胞保护作用,增加星形胶质细胞神经营养因子的释放量,可能进一步发挥神经元保护作用。