miR-126-5p通过靶向TRAF3抑制糖氧剥夺再灌注介导的HT22细胞凋亡和炎症

目的探讨miR-126-5p通过靶向肿瘤坏死因子受体相关因子3(tumor necrosis factor receptor-associated factor 3,TRAF3)对糖氧剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)介导的小鼠海马神经元细胞HT22细胞凋亡和炎症的影响。方法模拟缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R)损伤在体外建立氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)细胞模型,分析miR-126-5p与TRAF3靶向关系及对HT22细胞凋亡和炎症反应的影响。结果与对照组比较,OGD/R组中miR-126-5p下调而TRAF3 mRNA及蛋白水平上调,细胞存活率及Bcl-2蛋白水平降低,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量、细胞凋亡率、Bax及Cleaved caspase-3蛋白水平升高(P均<0.05)。与OGD/R+mimic-NC组比较,OGD/R+miR-mimic组、OGD+miR-mimic+pcDNA组TRAF3蛋白水平、LDH释放量、细胞凋亡率、Bax及Cleaved caspase-3蛋白水平明显降低,细胞存活率及Bcl-2蛋白水平升高,而OGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3组各指标升高,细胞存活率明显下降(P均<0.05)。结论miR-126-5p通过靶向TRAF3,抑制OGD/R介导的HT22细胞凋亡和炎症反应,从而对神经元细胞发挥保护作用。

Cu-ATSM保护内皮细胞糖氧剥夺再灌注损伤的机制

目的:探讨铜-二乙酰-2(N4-甲基氨基硫脲)(Cu-ATSM)对糖氧剥夺再灌注(OGD/R)后人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的作用及其潜在机制。方法:将体外培养的HUVECs分为Control组、OGD/R组、OGD/R+Cu-ATSM组;采用流式细胞术检测HUVECs的凋亡情况;采用Mito-tracker染色检测线粒体形态;JC-1染色分析各组线粒体膜电位的变化;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测各组自噬相关蛋白如ATG5、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ的激活情况;采用免疫荧光检测各组细胞LC3Ⅱ的表达情况。结果:流式细胞术结果显示,与Control组比,OGD/R损伤后HUVECs凋亡数目显著上升,而当Cu-ATSM治疗后,凋亡的HUVECs显著减少(均P<0.05)。Mito-tracker及JC-1染色结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后线粒体的形态明显受到损伤,线粒体功能受损,膜电位下降,而OGD/R+Cu-ATSM组治疗后能够改善损伤的线粒体功能,维持线粒体形态和线粒体膜电位(均P<0.05)。Western blot结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后自噬相关信号通路如ATG5、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白的表达量增多,而OGD/R+Cu-ATSM组治疗后的自噬相关蛋白表达量较OGD/R组下降(均P<0.05)。免疫荧光结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后LC3Ⅱ的表达显著增多,而OGD/R+Cu-ATSM治疗后的LC3Ⅱ显著减少。结论:Cu-ATSM能够改善HUVECs OGD/R损伤后的线粒体功能,减少HUVECs凋亡,其机制可能是通过抑制自噬实现的。

糖氧剥夺再灌注对PC12细胞自噬、凋亡的影响及意义

目的观察糖氧剥夺再灌注对PC12细胞自噬、凋亡的影响,探讨激活自噬调控神经元损伤修复的有效时间窗。方法将高分化的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞随机分为四组,分别置于缺氧(1%O2、5%CO2、94%N2)环境中培养0 h(OGD 0 h组)、1 h(OGD 1 h组)、2 h(OGD 2 h组)、3 h(OGD 3 h组);换用含10%灭活胎牛血清的高糖双抗DMEM培养液,正常条件下继续培养,分别培养0、4、8、12 h;采用CCK-8法检测四组各时间点细胞增殖率,采用RT-PCR法检测自噬基因微管相关蛋白2轻链3(LC3-Ⅱ)、凋亡基因Caspase-3相对表达量。结果 OGD 1 h组灌注后各时间点细胞增殖率均高于同时间点OGD 2 h及OGD 3 h组,组间比较P均<0.05;三组再灌注4、8、12 h时细胞增殖率均逐渐降低(P均<0.05),0、4 h时细胞增殖率比较差异无统计学意义(P均>0.05)。四组再灌注4 h时LC3-Ⅱ相对表达量均低于同组0 h,OGD 1 h、OGD 2 h组再灌注4 h时Caspase-3相对表达量均低于同组0 h,OGD 1 h、OGD 2 h组再灌注12 h时LC3-Ⅱ、Caspase-3相对表达量均高于同组4、8 h,组间及组内比较P均<0.05。结论糖氧剥夺再灌注可诱导PC12细胞发生自噬及凋亡,半暗带修复时间窗以糖氧剥夺4h内为宜。

红景天苷调节Nrf2/ARE信号通路对氧糖剥夺再灌注诱导的神经元铁死亡的影响

目的 探讨红景天苷调节核因子-E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路对氧糖剥夺再灌注(OGD/R)诱导的神经元铁死亡的影响。方法 将小鼠神经元细胞HT22随机分为对照组、模型组、红景天苷低剂量(20μmol/L)组、红景天苷高剂量(40μmol/L)组、红景天苷(40μmol/L)+ML385(Nrf2抑制剂,1μmol/L)组,除对照组外其余组细胞均进行OGD/R诱导。通过MTT和CCK-8法检测各组细胞活性和增殖能力;铁试剂盒检测细胞内铁浓度;商品化试剂盒检测各组细胞GPX4、SOD、MDA、ROS活性;透射电镜观察大鼠神经元超微结构的变化;Western Blot检测GPX4、COX2、ACSL4及NRF2/ARE信号通路相关蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组神经元细胞超微结构被破坏,线粒体缩小,嵴消失,外膜破裂,细胞活力和增殖率、GPX4、SOD活性、Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表达显著降低,Fe^(2+)浓度、MDA、ROS活性、COX2、ACSL4蛋白表达显著升高(P<0.05)。与模型组比较,红景天苷低、高剂量组细胞超微结构明显改善,细胞活力和增殖率、GPX4、SOD活性、Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表达显著升高,Fe^(2+)浓度、MDA、ROS活性、COX2、ACSL4蛋白表达显著降低(P<0.05)。与红景天苷高剂量组比较,红景天苷+ML385组显著逆转了上述指标变化。结论 红景天苷能够激活Nrf2/ARE信号通路抑制OGD/R诱导的神经元铁死亡。

脑络欣通促进氧糖剥夺/再灌注损伤大鼠的脑微血管内皮细胞血管新生:基于激活caspase-1/Gasdermin D/通路

目的探讨脑络欣通(NLXTD)含药血清对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)焦亡及血管新生的影响和可能作用机制。方法BMECs体外培养,分别经OGD/R诱导、NLXTD含药血清处理及siRNA转染caspase-1,设置Control组:BMECs+10%空白血清;OGD/R组:BMECs+OGD/R+10%空白血清;NLXTD组:BMECs+OGD/R+10%NLXTD含药血清;siRNA-NC组:BMECs转染siRNA-NC+OGD/R+10%空白血清;si-caspase-1组:BMECs转染si-caspase-1+OGD/R+10%空白血清;si-caspase-1+NLXTD组:BMECs转染si-caspase-1+OGD/R+10%NLXTD含药血清。采用CCK-8法、Transwell小室实验、管腔形成实验分别检测细胞增殖、迁移、成管能力;试剂盒测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;ELISA法检测培养液中炎性因子IL-1β、IL-18的含量;Western blot检测细胞焦亡相关蛋白pro-caspase-1、caspase-1、NLRP3、Gasdermin D及血管生成关键蛋白VEGF,VEGFR2的表达。结果BMECs经OGD/R诱导后出现明显的损伤;与OGD/R组比较,10%的NLXTD含药血清能显著提高OGD/R损伤BMECs的存活率、迁移能力及成管能力(P<0.01),降低IL-1β、IL-18的含量以及LDH的释放(P<0.01);Western blot实验结果显示,NLXTD含药血清可上调OGD/R损伤BMECs的VEGF和VEGFR2蛋白表达(P<0.01),并降低pro-caspase-1、caspase-1、NLRP3、Gasdermin D的蛋白表达(P<0.01),加入caspase-1 siRNA后,能进一步促进VEGFR2蛋白表达(P<0.01)。结论NLXTD可以提高OGD/R损伤后的BMECs增殖、迁移、成管能力,促进血管新生,其机制可能与抑制细胞焦亡caspase-1/Gasdermin D通路,减轻BMECs损伤,上调VEGF、VEGFR2水平有关。

普拉克索下调TXNIP表达对氧糖剥夺/再灌注心肌细胞p38/JNK通路的作用研究

目的探究普拉克索对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)心肌细胞的作用及其可能的作用机制。方法CCK-8检测细胞活力;试剂盒检测LDH和CK-MB活性、MDA和SOD含量;流式细胞术检测ROS产生和细胞凋亡;Western blot检测硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、p-p38、p38、p-JNK和JNK蛋白表达;qRT-PCR检测TXNIP mRNA表达。结果与对照组比较,OGD/R组心肌细胞活力、SOD含量明显降低(P<0.05),而LDH活性、CK-MB活性、ROS产生、MDA含量和细胞凋亡率明显升高(P<0.05),TXNIP、p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达明显升高(P<0.05);与OGD/R组比较,Pra-50μmol/L组和Pra-100μmol/L组心肌细胞活力、SOD含量明显升高(P<0.05),而LDH活性、CK-MB活性、ROS产生、MDA含量和细胞凋亡率明显降低(P<0.05),TXNIP、p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达明显降低(P<0.05),且普拉克索的作用呈剂量依赖性;与Pra-100μmol/L组比较,Pra-100μmol/L+oe-NC组心肌细胞各指标差异无统计学意义(P>0.05);与Pra-100μmol/L+oe-NC组比较,Pra-100μmol/L+oe-TXNIP组心肌细胞活力、SOD含量明显降低(P<0.05),而LDH活性、CK-MB活性、ROS产生、MDA含量和细胞凋亡率明显升高(P<0.05),TXNIP mRNA表达和TXNIP、p-p38/p38、p-JNK/JNK蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论普拉克索通过下调TXNIP表达抑制p38/JNK通路活化,改善心肌细胞OGD/R损伤。

Zeste基因增强子同源物2抑制剂减轻氧糖剥夺/再灌注诱导的神经元氧化应激和铁死亡

目的探讨Zeste基因增强子同源物2(EZH2)抑制剂GSK126在神经元缺血-再灌注损伤中的作用及机制。方法采用海马神经元HT22细胞制备氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型。细胞分为正常对照组(Control组)、OGD/R模型组(OGD/R组)和OGD/R模型+低、中、高浓度EZH2抑制剂组(OGD/R+GSK1260.5、1、5μmol/L组)。采用CCK-8法、流式细胞术检测各组HT22细胞损伤,相应试剂盒检测细胞氧化应激指标活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值。通过荧光探针C11 BODIPY 581/591和FerroOrange检测细胞内铁死亡指标脂质过氧化物(Lipid ROS)和Fe^(2+)含量。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印记法(Western blot)实验检测细胞EZH2、NRF2、HO-1、SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白表达。结果与Control组比较,OGD/R组HT22细胞活力降低,细胞死亡率升高,细胞内ROS水平升高,MDA含量增加,GSH/GSSG比值减少,Lipid ROS、Fe^(2+)含量增加,EZH2的mRNA和蛋白表达升高,NRF2、HO-1、SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白表达均降低(P值均<0.05)。与OGD/R组比较,OGD/R+GSK1260.5、1、5μmol/L组HT22细胞活力均升高,细胞死亡率均下降,细胞内ROS水平均下降,MDA含量均减少,GSH/GSSG比值均增加,Lipid ROS、Fe^(2+)含量均减少,EZH2的mRNA和蛋白表达均降低,NRF2、HO-1、SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白表达均升高(P值均<0.05)。结论EZH2抑制剂GSK126可减轻OGD/R诱导的神经元细胞损伤,其机制可能与NRF2/HO-1通路抑制氧化应激和SLC7A11/GPX4通路抑制铁死亡有关。

孪药ST-11对氧糖剥夺/再灌注致PC12细胞损伤的保护作用及机制

目的研究川芎嗪-灯盏乙素苷元孪药ST-11对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)致大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤的保护作用及机制。方法将细胞分为空白组、模型组、尼莫地平组(阳性对照,5μmol/L)、ST-11不同浓度组(5、10、20μmol/L)。预先给药干预24 h后,除空白组外的其余各组细胞均以含10 mmol/L Na_(2)S_(2)O_(4)的无糖DMEM培养基缺糖缺氧培养4 h,待复糖复氧培养4 h后,检测各组细胞的存活率,细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量,细胞凋亡率,细胞活性氧(ROS)和线粒体膜电位(MMP)水平,以及B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)及胱天蛋白酶3(caspase-3)蛋白的表达情况。结果与空白组比较,模型组的细胞存活率,上清液中CAT、GSH和SOD含量,细胞MMP水平,细胞Bcl-2蛋白的相对表达量和Bcl-2/Bax比值均显著降低(P<0.05),而上清液中LDH、MDA含量,细胞ROS水平,细胞凋亡率,细胞Bax、caspase-3蛋白的相对表达量均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,ST-11各浓度组上述指标(5μmol/L ST-11组caspase-3蛋白除外)均显著逆转(P<0.05)。结论ST-11对OGD/R致PC12细胞损伤具有一定的保护作用,且作用可能与减少细胞氧化应激、抑制细胞凋亡有关。

衰老SH⁃SY5Y细胞氧糖剥夺/再灌注模型的建立

目的:探讨衰老SH‑SY5Y细胞氧糖剥夺/再灌注模型的建立。方法:将SH‑SY5Y细胞随机分为对照(D‑半乳糖0 mmol/L)、D‑半乳糖(25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L)组,分别给予对应浓度的D‑半乳糖处理48 h,显微镜观察细胞形态的改变、β‑半乳糖苷酶试剂盒检测β‑半乳糖苷酶活性、EdU试剂盒检测细胞增殖率以及CCK‑8法检测细胞存活率,确定D‑半乳糖致衰浓度,建立衰老模型。将衰老SH‑SY5Y细胞随机分为对照(氧糖剥夺不处理)、氧糖剥夺处理(0.5 h、1 h、1.5 h、2 h)组,随后复糖复氧24 h,CCK‑8检测衰老SH‑SY5Y细胞存活率。结果:25 mmol/L、50 mmol/L组的细胞形态、β‑gal活性与对照组比较没有明显变化(P>0.05),100 mmol/L组细胞可见胞体肥大,200 mmol/L组细胞染色质固缩,400 mmol/L组细胞出现大量空泡化;(100 mmol/L~400 mmol/L)组细胞β‑半乳糖苷酶染色阳性率与对照组比明显升高(P<0.05),100 mmol/L、200 mmol/L组间差异不大(P>0.05);(100 mmol/L~400 mmol/L)组细胞增殖能力明显下降,呈浓度依赖性降低(P<0.05);细胞存活率呈浓度依赖性降低(P<0.05),IC50在100 mmol/L和200 mmol/L之间。衰老SH‑SY5Y细胞存活率呈氧糖剥夺时间依赖性降低(P<0.05),IC50接近1 h。结论:D‑半乳糖浓度为100 mmoL/L且作用细胞48 h,可建立存活率约50%的衰老SH‑SY5Y细胞模型,氧糖剥夺衰老SH‑SY5Y细胞1 h再灌注24 h可建立存活率接近50%的衰老SH‑SY5Y细胞氧糖剥夺/再灌注模型。

龙胆苦苷对新生大鼠氧糖剥夺再灌注损伤海马神经元Caspase-3、Bax和Bcl-2表达的影响

目的探讨龙胆苦苷(GP)对新生大鼠氧糖剥夺再灌注损伤海马神经元的抗凋亡保护作用及机制。方法采用无糖培养基加缺氧法建立原代新生大鼠海马神经元氧糖剥夺再灌注损伤模型,同时给予不同浓度的龙胆苦苷进行干预。应用Hoechst 33342染色法检测神经细胞的凋亡,并计算凋亡率;化学比色法测定神经细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率;RT-PCR和Western blotting技术检测凋亡相关因子Caspase-3、Bax和Bcl-2 m RNA和蛋白的表达。结果与正常组比较,模型组Hoechst 33342染色神经元凋亡率明显升高,LDH漏出率增加,Caspase-3、Bax m RNA和蛋白的表达水平上调,Bcl-2 m RNA和蛋白的表达水平下降。与模型组比较,龙胆苦苷(40、20、10mg/L)可显著降低氧糖剥夺再灌注损伤神经元的凋亡率和LDH漏出率;龙胆苦苷(40mg/L)可明显抑制Caspase-3、Bax m RNA和蛋白的表达,升高Bcl-2 m RNA和蛋白的表达。结论龙胆苦苷对新生大鼠海马神经元氧糖剥夺再灌注损伤所诱发的神经细胞凋亡具有保护作用,其机制可能与上调Bcl-2表达,抑制Caspase-3、Bax表达有关。

HDAC9沉默抑制新生大鼠海马神经元氧糖剥夺/再灌注损伤

目的:研究组蛋白去乙酰化酶9(HDAC9)对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)诱导的新生大鼠海马神经元损伤的影响及其机制,为研究新生儿缺氧缺血性脑损伤奠定基础。方法:体外培养新生SD大鼠海马神经元,建立OGD/R损伤模型。用real-time PCR和Western Blot分别检测HDAC9 m RNA和蛋白表达;转染HDAC9 si RNA沉默其表达,并将细胞分为空白对照组、OGD/R组、OGD/R+scramble si RNA组和OGD/R+HDAC9 si RNA组;MTT法测定神经细胞的存活率,乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒检测LDH漏出率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western Blot检测细胞Bax、Bcl-2和p-STAT3的蛋白表达。此外,用JAK2抑制剂AG490预处理细胞,评价JAK2/STAT3通路在HDAC9沉默对海马神经元OGD/R损伤中的作用。结果:HDAC9在OGD/R损伤的在新生大鼠海马神经元细胞中高表达(P<0.05);转染HDAC9 si RNA后,细胞HDAC9表达降低(P<0.05);在OGD/R诱导的海马神经元细胞中,下调HDAC9的表达能够显著提高细胞活性,降低LDH渗出率,减少神经细胞凋亡,下调Bax表达,上调Bcl-2表达,上调p-STAT3的表达(P<0.05),此外,AG490部分逆转HDAC9沉默对新生大鼠海马神经元细胞OGD/R损伤的抑制作用(P<0.05)。结论:HDAC9沉默通过JAK2/STAT3通路抑制新生大鼠海马神经元OGD/R损伤。

TRB3沉默对氧糖剥夺/再灌注诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞损伤的影响

目的探讨Tribbles同源蛋白3(TRB3)对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞损伤的影响。方法分离培养新生SD大鼠的脊髓星形胶质细胞,设置对照组(不做任何处理)、OGD/R组(进行OGD/R处理),采用Real-time PCR和Western blotting分别检测TRB3 mRNA和蛋白的表达;设置对照组(不做任何处理)、Scramble组(感染阴性对照慢病毒)与shTRB3组(感染TRB3 shRNA慢病毒),采用Real-time PCR和Western blotting分别检测TRB3 mRNA和蛋白的表达,确定TRB3 shRNA慢病毒干扰效率;设置对照组(正常培养)、OGD/R组(进行OGD/R处理)、shTRB3组(感染TRB3 shRNA慢病毒)、Scramble组(感染阴性对照慢病毒)、OGD/R+shTRB3组(感染TRB3 shRNA慢病毒后,进行OGD/R处理)与OGD/R+Scramble组(感染阴性对照慢病毒后,进行OGD/R处理),采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,CCK-8法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒测定LDH漏出率,硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平,Western blotting检测核因子κB(NF-κB)p65蛋白表达水平。使用NF-κB p65激动剂白桦脂酸(BA)20μmol/L处理OGD/R组和OGD/R+shTRB3组细胞,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果Real-time PCR和Western blotting检测结果显示,OGD/R处理后,脊髓星形胶质细胞中TRB3 mRNA(2.15±0.12 vs.1.00±0.05)和蛋白(2.10±0.16 vs.1.00±0.08)表达水平明显升高(P<0.05);与对照组比较,shTRB3组星形胶质细胞中TRB3 mRNA(0.30±0.07 vs.1.00±0.10)和蛋白(0.30±0.04 vs.1.00±0.06)表达水平明显降低(P<0.05),表明TRB3 shRNA慢病毒感染成功。与对照组比较,OGD/R组、OGD/R+Scramble组星形胶质细胞活性、SOD活性及细胞核NF-κB p65蛋白表达水平明显降低,LDH漏出率、MDA含量、TNF-α水平、IL-1β水平及细胞凋亡率明显增高(P<0.05);与OGD/R组和OGD/R+Scramble组比较,OGD/R+shTRB3组星形胶质细胞活性、SOD活性及细胞核NF-κB p65蛋白表达水平明显增高,LDH漏出率、MDA含量、TNF-α水平、IL-1β水平及细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。与OGD/R组比较,BA处理能明显提高细胞凋亡率(36.15%±0.87%vs.24.70%±1.05%,P<0.05);与OGD/R+shTRB3组比较,BA处理能逆转TRB3 shRNA慢病毒感染对OGD/R诱导的细胞凋亡的抑制作用(22.00%±1.04%vs.13.91%±1.20%,P<0.05)。结论TRB3沉默可能通过阻断NF-κB通路而减轻OGD/R诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞损伤。

大蒜素对氧糖剥夺再灌注致PC12细胞损伤的保护作用及抗氧化应激机制

目的探讨大蒜素(AL)保护氧糖剥夺再灌注(OGD/RP)致PC12细胞损伤的抗氧化应激机制。方法采用无糖的Earle’s平衡盐溶液加缺氧法复制氧糖剥夺再灌注致PC12细胞损伤模型,同时给予不同浓度的大蒜素进行干预。采用MTT法检测细胞存活率;化学比色法测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率;Hoechst 33342染色法检测大蒜素对细胞凋亡的影响,并计算凋亡率;生化法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性或含量;RT-PCR和Western blotting分子生物学方法检测氧化应激相关因子SOD、肿瘤坏死因子(TNF-α)、过氧化氢酶(CAT)mRNA和蛋白的表达。结果与正常对照组比较,OGD/RP模型组PC12细胞存活率下降,LDH漏出率、细胞凋亡率明显升高;细胞SOD、GSH-Px活性明显降低,MDA含量明显升高;细胞SOD、CAT mRNA及蛋白表达明显下降,TNF-αmRNA及蛋白表达明显增加。与模型组比较,大蒜素(60、30mg/L)可显著升高OGD/RP PC12细胞的存活率,降低凋亡率和LDH漏出率;大蒜素(60、30mg/L)可显著升高OGD/RP PC12细胞SOD、GSH-Px活性,减少MDA含量;大蒜素(60mg/L)可明显升高OGD/RP PC12细胞SOD、CAT mRNA及蛋白表达,降低TNF-αmRNA及蛋白表达。结论大蒜素对OGD/RP致PC12细胞损伤具有保护作用,其机制与抗氧化应激有关。

糖氧剥夺再灌注对SH-SY5Y细胞焦亡的影响

目的探讨细胞焦亡在糖氧剥夺诱导的人神经母细胞瘤细胞(Human neuroblastoma cells, SH-SY5Y)损伤中的作用。方法用不同糖氧剥夺时间(0、3、6、12 h)处理SH-SY5Y细胞,然后进行再灌注24 h;Hoechst33342/碘化丙啶(Propidine iodide, PI)染色试剂盒观察细胞膜破裂情况;原位末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)/天冬氨酰特异性半胱氨酰蛋白酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1)共染检测细胞焦亡;蛋白免疫印迹法检测焦亡相关指标[核苷酸结合寡聚化结构导致域样受体蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、Caspase-1、Pro-caspase-1、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β),Pro-IL-1β]的表达水平;使用Caspase-1抑制剂(Belnacasan, VX-765)处理糖氧剥夺/再灌注细胞模型,观察其对细胞焦亡的影响。结果糖氧剥夺再灌注处理呈时间依赖诱导SH-SY5Y细胞损伤,并诱导细胞焦亡,焦亡相关指标(NLRP 3,Caspase-1,IL-1β)表达水平升高。VX-765可减轻糖氧剥夺再灌注诱导的SH-SY5Y细胞焦亡,降低焦亡相关指标(Caspase-1,Pro-IL-1β,IL-1β)的表达水平。结论细胞焦亡在糖氧剥夺再灌注诱导的SH-SY5Y细胞损伤中起到重要作用。

糖氧剥夺/再灌注促进L2.3神经干细胞内源性Huwe1蛋白表达

目的建立L2.3神经干细胞糖氧剥夺/再灌注损伤模型,探讨糖氧剥夺/再灌注是否可以促进L2.3神经干细胞内源性Huwe1蛋白表达。方法将L2.3神经干细胞糖氧剥夺6h,根据不同组别再灌注培养8h、16、24h,建立L2.3神经干细胞/再灌注损伤模型。将体外培养的L2.3神经干细胞分成5组:正常对照组(control组)、糖氧剥夺组(OGD)、糖氧剥夺/再灌注8h组(OGD6h+R8h组)、糖氧剥夺/再灌注16h组(OGD6h+R16h组)、糖氧剥夺/再灌注24h组(OGD6h+R24h组)。Control组:该组L2.3神经干细胞不进行糖氧剥夺处理。OGD组:该组L2.3神经干细胞仅仅进行糖氧剥夺6h。OGD6h+R8h组:该组L2.3神经干细胞经历OGD6h后再灌注培养8h。OGD6h+R16h组:该组L2.3神经干细胞经历OGD6h后再灌注培养16h。OGD6h+R24h组:该组L2.3神经干细胞经历OGD6h后再灌注培养24h。结果与Control组比,OGD组L2.3神经干细胞糖氧剥夺6h后,活细胞比例明显减少[(94.15±3.59)vs(56.05±5.01),P<0.01];与OGD前比,OGD6再灌注8h Huwe1蛋白表达开始增加,OGD6h再灌注16h和OGD6h再灌注24h Huwe1蛋白表达量显著增加,Huwe1蛋白表达的条带明显变粗变浓,OGD6h再灌注16h最明显。结论糖氧剥夺可引起L2.3神经干细胞损伤;糖氧剥夺/再灌注可以促进L2.3神经干细胞内源性Huwe1蛋白表达。

二氢杨梅素减轻氧糖剥夺/再灌注所致的神经元氧化应激损伤及机制

目的探讨二氢杨梅素对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)导致的神经元氧化应激损伤的影响和可能的作用机制。方法体外培养大脑皮质原代神经元细胞,建立OGD/R损伤细胞模型。利用不同浓度的二氢杨梅素处理神经元细胞,2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧(ROS)水平。以超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)为细胞氧化水平的指标。细胞核质分离方法检测核因子E2相关因子(Nrf2)核/质转位情况,免疫印迹法检测血红素氧合酶1(HO-1)的蛋白表达。结果与OGD/R组相比,二氢杨梅素处理组细胞生存率显著提高,ROS和MDA水平降低,SOD活性增高。同时二氢杨梅素处理增高了HO-1的蛋白表达并影响Nrf2的核质转位。结论二氢杨梅素通过激活Nrf2/HO-1抗氧化通路抑制OGD/R所致的原代神经元细胞氧化应激损伤。

氧糖剥夺-再灌注星型胶质细胞内皮素-1过表达对神经干/祖细胞增殖的影响

目的探讨氧糖剥夺-再灌注(OGD-R)星型胶质细胞内皮素(ET)-1过表达对神经干/祖细胞(NSPCs)增殖的影响。方法构建阴性对照星型胶质细胞(C6-Mock)和ET-1过表达的星形胶质细胞(C6-ET-1)OGD-R模型,并构建星型胶质细胞与NSPCs Transwell共培养体系。对星型胶质细胞及原代NSPCs进行形态观察及鉴定;将细胞分为以下4组进行共培养:C6-Mock+NSPCs组,OGD-R+C6-Mock+NSPCs组,C6-ET-1+NSPCs组,OGD-R+C6-ET-1+NSPCs组,共培养0、24、48、72 h,分析各组NSPCs神经球直径。结果 C6-Mock及C6-ET-1均呈现Ⅰ型星型胶质细胞的纤维状形态,神经胶质酸性纤维蛋白(GFAP)表达于这两种细胞的胞质中。原代NSPCs的巢蛋白(nestin)染色阳性。共培养后的48 h及72 h,OGD-R+C6-Mock+NSPCs组神经球的直径明显大于C6-Mock+NSPCs组的直径,OGD-R+C6-ET-1+NSPCs组神经球的直径明显大于C6-ET-1+NSPCs组的直径,同时OGD-R+C6-ET-1+NSPCs组神经球的直径明显大于OGD-R+C6-Mock+NSPCs组的直径,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 OGD-R星型胶质细胞促进NSPCs的增殖,且ET-1过表达进一步促进了NSPCs的增殖。

氧糖剥夺再灌注对小鼠小胶质细胞炎症反应的影响

目的:探讨氧糖剥夺/复氧复糖(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)对小胶质细胞炎症反应的影响。方法:将小胶质细胞随机分为空白对照组、氧糖剥夺(OGD)2h、OGD4h、OGD6h。从普通培养箱中取出小胶质细胞,将原培养基更换为无糖Earles平衡盐溶液(Earles Balanced Salt Solution,EBSS)培养,并置于缺氧培养箱内,建立小胶质细胞OGD模型。OGD后换回原培养基,重新置于普通培养箱,复糖、复氧24h后观察及收集培养上清。ELISA法检测各组细胞培养上清中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。结果:随着OGD时间的延长,小胶质细胞损伤逐渐加重,以OGD6小时为甚。与对照组相比较,OGD各组IL-1β、IL-6的分泌明显增加(P<0.05),其中IL-1β表达在OGD 2h组达到高峰,IL-6表达在OGD 4h组达到高峰,OGD6h组炎症因子的表达出现回落。结论:氧糖剥夺2-4小时后再复糖复氧能较好地在体外诱导小胶质细胞炎症反应,且细胞损伤较少。

中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子对糖氧剥夺/再灌注诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

目的研究中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)对糖氧剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)损伤的保护作用。方法体外培养SH-SY5Y细胞,对细胞进行糖氧剥夺(OGD)6 h,再灌注(R)12 h。在再灌注时期,根据是否给予重组人MANF蛋白处理(2μmol·L-1,12 h),将细胞分为正常对照组(NC)、NC+MANF组、OGD/R组和OGD/R+MANF组。随后光学显微镜下观察SH-SY5Y细胞形态的改变,MTT法检测细胞存活率,PI染色法检测细胞死亡率,免疫印迹法检测内源性MANF蛋白、内质网(ER)应激相关蛋白GRP78/Bi P、p-IRE1、p-e IF2α及促凋亡蛋白cleaved caspase-3和CHOP的表达。结果光学显微镜下可见OGD/R组SH-SY5Y细胞胞体变小、变圆,突起缩短或消失。进一步研究发现,MANF能明显改善OGD/R诱导的SHSY5Y细胞存活率下降和死亡率增加。免疫印迹法检测发现:OGD/R组细胞内源性MANF蛋白表达增高;ER应激相关蛋白GRP78/Bi P、p-IRE1、p-e IF2α表达增高;促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表达明显高于NC组。给予重组人MANF蛋白可降低OGD/R组GRP78/Bi P、CHOP及cleaved caspase-3的表达水平。结论 OGD/R可诱导凋亡性ER应激;MANF蛋白可通过抑制OGD/R诱导的凋亡性ER应激而对SH-SY5Y细胞具有保护作用。

补阳还五汤激活PI3K-AKT通路促进氧糖剥夺再灌注损伤的脑微血管内皮细胞血管生成

目的:探讨补阳还五汤促进氧糖剥夺再灌注(OGD/R)损伤的大鼠脑微血管内皮细胞(RBMEC)血管生成的机制。方法:RBMEC经补阳还五汤含药血清孵育24 h后,构建OGD/R细胞损伤模型。将细胞随机分为正常对照组、模型对照组、补阳还五汤组(给予补阳还五汤含药血清)和LY294002组[给予补阳还五汤含药血清前使用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002预处理1 h]。采用CCK-8法、细胞划痕实验和Transwell迁移实验、管腔形成实验分别检测细胞增殖、迁移和形成管腔能力。蛋白质印迹法检测PI3K、蛋白激酶B(AKT)、低氧诱导因子(HIF)-1α及血管内皮生长因子(VEGF)等蛋白的表达。结果:与模型对照组比较,补阳还五汤组RBMEC存活率、迁移能力及管腔形成能力显著增强(均P<0.01),磷酸化PI3K、磷酸化AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达增加(均P<0.05),而LY294002可阻断上述效应。结论:补阳还五汤含药血清可促进OGD/R损伤的RBMEC血管生成,其机制可能与其激活PI3K-AKT信号通路上调HIF-1α和VEGF表达有关。