糖皮质激素受体GR真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建糖皮质激素GR的真核表达载体,为探讨GR与中医肾阳虚的关系奠定基础。方法:以GR基因为靶基因,以pBS/U6-Neo质粒为载体,设计构建重组体,根据GR mRNA基因序列,设计有小发夹结构的2对寡核苷酸序列,克隆到空载体pBS/U6-Neo,转化DH5a菌株,提取质粒,进行PCR鉴定和测序分析。结果:经PCR鉴定筛出的重组体测序结果与目的序列相同,重组载体构建成功。结论:利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体,为后续稳定转染及培育转基因小鼠奠定基础。

逍遥散对应激损伤大鼠糖皮质激素受体(GR)的调控

目的用逍遥散和GR-受体阻滞剂干预慢性应激损伤大鼠,观察其海马区糖皮质激素受体(GR)亚型表达情况。方法以逍遥散(5.265 g.kg-1)和糖皮质激素受体(GR)受体阻滞剂RU-38486(12.5 g.kg-1)为干预药物,应用慢性不可预知应激对大鼠进行为期3周的造模,在造模的同时给予实验药物,3周后停止刺激,于第22天处死大鼠取材。采用荧光免疫组织化学法,测定各组大鼠海马区GR表达。结果 GR受体阻滞剂RU-38486与中药复方逍遥散可显著上调慢性应激损伤大鼠海马区GR阳性表达。结论逍遥散可以通过促进慢性应激损伤大鼠海马区NR表达上调,从而达到部分恢复慢性应激大鼠HPA轴负反馈功能的作用,起到缓减诸应激症状的疗效。

糖皮质激素受体与阴阳虚证关系的初步探讨

通过临床和动物实验研究的总结回顾 ,探讨糖皮质激素受体 (GR)与阴阳虚证的关系。研究结果提示糖皮质激素受体降低是阴阳虚证发展到一定阶段的病理基础之一 ,且GR下降无特异性 ;参附汤、生脉饮救治阴阳虚证的机理之一是通过增加细胞内GRmRNA的表达以升高GR ;并就以往的研究成果 ,提出了新的假说及相应的研究思路。

人参皂苷Rg_1诱导人肝HL-7702细胞糖皮质激素受体报告基因表达的作用

目的探讨人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1,G-Rg1)对人肝HL-7702细胞糖皮质激素受体(GR)的调节作用。方法将含有糖皮质激素受体反应元件(GRE)的荧光素酶报告基因的表达质粒载体pGRE-tk-LUC与内参照基因载体质粒pRL-SV40,通过脂质体介导瞬时转染至人肝HL-7702细胞中,利用双荧光素酶报告基因检测系统,观察报告基因的表达变化;利用Western blotting方法检测药物对细胞GR蛋白表达的影响。结果G-Rg1与地塞米松均可诱导pGRF-tk-LUC报告基因表达,且呈剂量依赖性,而且这种诱导作用可以被糖皮质激素受体阻断剂RU486(Mifepristone)所阻断,G-Rg1对细胞GR蛋白表达有显著的抑制作用。结论G-Rg1在体外能够表现出一些类似糖皮质激素样的生物活性,可能是GR的配体。

淫羊藿、女贞子协同地塞米松影响哮喘大鼠糖皮质激素受体的研究

目的观察中药淫羊藿、女贞子对地塞米松干预大鼠哮喘模型全身及局部不同水平糖皮质激素受体(GR)的影响。方法建立大鼠哮喘模型,腹腔注射地塞米松2周治疗,同时配合灌胃淫羊藿女贞子煎液,流式细胞术检测支气管肺泡灌洗液(BALF)与血淋巴细胞中GR蛋白及GR结合力的表达。结果哮喘模型组血淋巴细胞及BALF中GR结合力均显著降低(P<0.05或P<0.01);与哮喘模型组比较,激素干预组BALF中GR蛋白表达量明显降低(P<0.01),血淋巴细胞及BALF中GR结合力均明显降低(P<0.05或P<0.01);应用激素的同时合用淫羊藿女贞子,能显著上调BALF中GR蛋白量(P<0.05)及血淋巴细胞及BALF中GR结合力(P<0.05或P<0.01)。结论在激素应用的同时合用中药淫羊藿、女贞子在整体及局部水平均能提高因糖皮质激素(GC)干预下降的GC结合力,改善GR对GC的耐受,提高支气管肺组织及机体对激素的敏感性。

糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23多态性与支气管哮喘的相关性研究

目的检测糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor,GR)基因外显子2/1密码子23多态性,从而探讨糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23与激素敏感型支气管哮喘的相关性。方法按标准方法从外周血白细胞中提取DNA,采用聚合酶链反应/单链构象多态性(Polymerase chain reaction/Single-strand conformation polymor-phism,PCR/SSCP)和基因测序技术,结合琼脂糖凝胶电泳,对20例哮喘患者(研究组)及20例健康对照组的糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23的基因型进行检测和分类。统计两组的各基因型频率,判断两组之间有无差异。统计学处理用χ2检验。结果经琼脂糖凝胶电泳显示哮喘组(20例)与健康对照组(20例)样本PCR产物片断长度约356 bp。SSCP分析显示哮喘组(20例)与健康对照组(20例)样本的电泳速率相同,提示无变异存在。行基因测序糖皮质激素受体外显子2/1密码子23基因型均为AGG。结论江西籍汉族人种中糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23基因未发现多态性的存在。糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23与激素敏感型支气管哮喘之间无明显联系。

糖皮质激素受体、盐皮质激素受体对肾阳虚证下丘脑-垂体-肾上腺轴影响研究概况

肾阳虚证的物质基础在于下丘脑-垂体-靶腺(肾上腺、甲状腺、性腺)轴的功能降低,其中下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴是最重要的神经内分泌网络之一。除了受到本身各个器官分泌的激素负反馈调节之外,该轴还受到大脑边缘系统海马等神经核团的影响,通过糖皮质激素受体(GR),盐皮质激素受体(MR)的介导发挥调节作用。阐述了GR、MR的生理结构及与HPA轴、海马之间关系,对肾阳虚证HPA轴的影响进行了综述。

甘草酸二铵与地塞米松联用对内毒素诱导ALI大鼠肺组织糖皮质激素受体表达的影响

目的探讨联合应用甘草酸二铵（DG）和地塞米松（DXM）对内毒素（LPS）所致急性肺损伤（Au）大鼠肺组织糖皮质激素受体（GR）及核因子-κB（NF-κB）表达的影响。方法将40只雄性SD大鼠随机分为生理盐水组、ALI组、DG干预组、DXM干预组和联合用药组（DG＋DXM）。除正常对照组外，其余各组均给予LPS5mg／kg尾静脉注射；LPS注射前1h，DG干预组给予DG20mg／kg静脉注射，DXM干预组给予DXM2mg／kg静脉注射，联合用药组同时给予DG20mg／kg和DXM2mg／kg静脉注射。采用逆转录-PCR反应检测肺组织GRmRNA及NF-KBmRNA的表达；ELISA法测定血清TNF-01、IL-10浓度，同时对大鼠肺组织病理、肺湿干比（W／D）及PaO：等指标进行比较分析。结果①Au组GRmRNA表达明显低于生理盐水组（P〈0．01），而DG干预组及联合用药组GRmRNA表达则明显高于Au组（分别P〈0．05，P〈0．01）；DG干预组、DXM干预组及联合用药组NF-κBmRNA表达均明显低于Au组（均P〈0．01）。②ALI组TNF-α明显高于生理盐水组、DG干预组、DXM干预组和联合用药组（均P〈0．01）。ALI组IL-10明显高于生理盐水组（P〈0．01），但低于DG干预组和联合用药组（均P〈0．01）。③Au组大鼠肺组织水肿明显、中性粒细胞部分浸润，而DG干预组、DXM干预组和联合用药组肺部炎症较Au组减轻。结论甘草酸二铵和地塞米松联用可上调大鼠GR及IL-10的表达，抑制NF-κB及TNF-α的过度表达，从而起到减轻ALI的作用。

糖皮质激素与抑郁发病相关机制研究进展

抑郁症是一种情感障碍性疾病,临床上以兴趣缺乏、情绪低落、睡眠障碍等为主要病症表现,部分患者常伴有自杀倾向。目前研究的抑郁发病机制主要有:单胺假说、神经营养再生假说、神经内分泌假说、表观遗传学假说。近年来的研究发现糖皮质激素和其受体在抑郁的发病机制中起着重要的作用。糖皮质激素是肾上腺分泌的一种激素,在长期应激的作用下,HPA轴持续激活,导致糖皮质激素的持续分泌,引起神经内分泌系统紊乱,在抑郁的发病机制中有重要意义。该文主要针对糖皮质激素及其受体对抑郁发病相关机制的研究进展进行综述。

糖皮质激素的信号转导系统

糖皮质激素(glucocorticoid,GC)是由肾上腺皮质分泌的甾体激素,糖皮质激素具有调节免疫、代谢、渗透压、生长发育等多种生理和药理作用,并参与行为和认知过程的调节。就糖皮质激素受体(GR)因子在GC信号通路中的地位、组成与分类、作用机制与结构特点、与临床疾病的关系及GR的最新研究进展作一综述。

PTSD样大鼠海马MR和GR变化的研究

目的研究PTSD大鼠海马神经元核受体MR(mineralocorticoid receptor,盐皮质激素受体)和GR(glu-cocorticoid receptor糖皮质激素受体)表达的变化。方法采用国际认定的SPS方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型,分别取SPS处理后24h、7d、14d大鼠脑组织;同时取正常脑组织(非SPS刺激)作为对照,应用免疫组化、Western Blot方法分别进行各组海马神经元GR和MR表达变化的观察及定量检测。结果(1)经SPS处理后,免疫组化和Western Blot结果显示海马神经元MR表达呈现随着24h、7d、14d逐渐下调的趋势;(2)经SPS处理后,免疫组化和Western Blot结果显示海马神经元GR表达于24h时下调,而7d、14d时呈现逐渐回升趋势。结论大鼠经SPS处理后,海马MR表现为持续下调状态;而GR表达为短暂下调,随后回调,揭示PTSD大鼠海马神经元核受体—MR和GR的表达变化可能是引发海马功能降低的重要因素之一。

RNA干扰联合Cre-loxP系统建立小鼠巨噬细胞RAW264.7 GR表达抑制模型

目的:应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)及Cre-loxP系统构建针对目的基因糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)表达抑制细胞模型。方法:设计并合成两对RNAi靶序列,连接至pBS/U6-Neo载体,联合应用Cre-loxP系统及RNAi构建针对目的基因GR的两对重组质粒,对构建的重组质粒采用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)及测序的方法进行鉴定,将构建成功的重组质粒及Cre-ERT2质粒稳定共转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,采用半定量逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)及Western blot的方法分别检测诱导RNAi表达后GR在mRNA及蛋白水平的表达情况。结果:构建的两个针对目的基因GR的重组质粒可显著降低GR在mRNA及蛋白水平的表达。结论:联合采用RNAi及Cre-loxP系统能可控的稳定降低小鼠巨噬细胞RAW264.7中的GR表达。

TCDCA对AA大鼠滑膜组织糖皮质激素受体基因表达的影响

为了观察牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)对大鼠佐剂性关节炎模型滑膜组织中糖皮质激素受体(GR)基因表达的影响,并探讨TCDCA对AA大鼠成纤维样滑膜细胞的作用机制,试验制备AA大鼠模型,分离AA大鼠滑膜组织,应用荧光定量RT-PCR技术检测TCDCA对AA大鼠滑膜组织GR mRNA表达的影响。结果表明:与对照组相比,模型组AA大鼠滑膜组织中的GR表达量显著增加(P<0.05);与模型组相比,低剂量(0.1g/kg)TCDCA口服治疗组AA大鼠的GR mRNA表达量显著增加(P<0.05)。说明TCDCA能显著促进AA大鼠滑膜组织GR mRNA的表达。

激素抵抗型哮喘发病机制的研究进展

激素抵抗型哮喘治疗困难,一直是哮喘研究的重点和难点。研究发现糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)异常、组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase,HDAC2)活性降低等经典机制在激素抵抗型哮喘发病中起重要作用。此外,Th细胞免疫失衡、感染、肥胖及非编码RNA、细胞自噬等因素在激素抵抗型哮喘中的作用也是近年研究的热点。本文对以上激素抵抗型哮喘发病机制的研究进展予以综述,以提高对激素抵抗型哮喘的认识,为未来的治疗提供方向。

糖皮质激素在儿童原发性免疫性血小板减少症治疗中的应用及对miR-15a表达的影响

目的探讨糖皮质激素(GC)在儿童原发性免疫性血小板减少症(ITP)治疗中的应用及对miR-15a表达的影响,为逆转GC抵抗及实现ITP的个体化治疗提供参考依据。方法选取2018年3月—2019年8月我院血液科住院治疗的患儿为研究对象,共50例,在50例ITP患儿中,治疗组为:28例ITP患儿接受了GC治疗(根据GC疗效分为GC敏感组18例和GC抵抗组10例);另外,空白对照组为:22例为ITP患儿未接受GC治疗。采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。采用SYBR green实时荧光定量PCR对纳入研究的患者的糖皮质激素受体α(glucocorticoid receptor alpha,GRα)、糖皮质激素受体β(glucocorticoid receptor beta,GRβ)、糖皮质激素受体γ(glucocorticoid receptor gamma,GRγ)和糖皮质激素受体p (glucocorticoidreceptorp,GRp) miR-15a的mRNA表达水平进行检测。对比分析ITP患儿治疗组(GC敏感组和GC抵抗组)与空白对照组,GC敏感组和GC抵抗组GR亚型表达的差异。采用Western blot检测ITP患儿GC敏感组、GC抵抗组和空白对照组的GRα和GR日蛋白水平。并且提取各组的血清样本PBMC中GRα和GRβmiR-15a的表达水平进行检测,并比较组间差异。结果ITP患儿治疗组(GC敏感组和GC抵抗组)GR亚型miR-15a表达差异大于空白对照组,患儿组GRα和GRβmiR-15a的表达水平高于空白对照组(P<0.05),患儿GC敏感组GRαmiR-15a为1.26(0.43~3.28),空白对照组为0.97 (0.32~1.52):患儿GC敏感组GRβmiR-15a为0.07 (0.01~0.51),空白对照组为0.03(0.01~0.06)。GRβ、γ、p含量较低,在部分患儿中无法检出。ITP患儿治疗组(GC敏感组和GC抵抗组)与空白对照组GRγ和GRp miR-15a表达无显著差异(P>0.05)。GC敏感组和GC抵抗组GRα、GRβ、GRγ和GRp miR-15a的表达均无显著差异(P>0.05),但GRα在GC敏感组为1.13 (0.32~2.75),GC抵抗组为0.84 (0.36~3.11),在GC敏感组呈升高趋势;GRγ在GC敏感组为0.22 (0.06~1.47),GC抵抗组为0.31 (0.01-3.26),GRγ在GC抵抗组呈上升趋势。GC敏感组GRα蛋白明显高于GC抵抗组(P<0.05)。GRβ蛋白在3组均未检出。结论ITP患儿的受体亚型表达数据范围较广,而空白对照组儿童GR亚型表达水平较稳定,数据范围较小,提示患儿的GR亚型表达水平可能受多因素调控,且ITP属于一种病因未明的疾病。初治ITP患儿存在GR表达水平上升,主要表现为GRα和GRβ表达水平上升。结合GRαmiR-15a在GC敏感组呈上升的趋势,GRα蛋白表达水平在GC敏感组明显上升,推测GRp可能对GC效应起到介导作用,但仍需进行深入研究以验证。

蒲郁胶囊对抑郁小鼠行为学、HPA轴及海马CREB-BDNF通路表达的影响

该研究首先亚慢性给药后用小鼠绝望模型强迫游泳试验(forced swimming test,FST)和悬尾试验(tail suspension test,TST)评估蒲郁胶囊的抗抑郁活性。随后采用慢性不可预知应激(chronic unpredictable stress,CUS)方案制备小鼠抑郁模型,用蔗糖偏好试验、开场试验和新奇抑制摄食试验评估蒲郁胶囊的抗抑郁药效。行为学测试后计算肾上腺指数,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清皮质酮(corticosterone,CORT)和促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH),蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测小鼠海马组织中糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的蛋白表达以及磷酸化cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)与总CREB的比例,以探讨蒲郁胶囊的抗抑郁作用及其机制。结果显示,蒲郁胶囊对绝望抑郁模型和CUS模型小鼠都具有显著的抗抑郁作用;同时药物可以预防CUS诱导的小鼠肾上腺指数变化,逆转抑郁小鼠血清中CORT和ACTH的异常激活;最后发现蒲郁胶囊还可以逆转CUS小鼠海马组织中较低的pCREB,BDNF和GR表达。以上结果充分说明蒲郁胶囊具有显著的抗抑郁作用,其机制与下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic pituitary adrenal, HPA)轴活性、GR和CREB-BDNF通路表达密切相关。

四逆散对抑郁大鼠BDNF/TrkB,5-HT/5-HT1AR及HPA轴的影响

目的:观察四逆散对抑郁大鼠脑神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体B(TrkB),5-羟色胺(5-HT)/5-HT1A受体(5-HT1AR)及下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的影响,探讨四逆散基于BDNF/TrKB,5-HT/5-HT1AR及HPA轴的抗抑郁作用机制。方法:120只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、四逆散低、中、高剂量组和氟西汀组,每组20只。除正常组外,其余5组连续21 d采用孤养结合慢性温和不可预知性刺激法(CUMS)制备抑郁大鼠模型。四逆散低、中、高剂量组分别灌胃(ig)四逆散(1.25,2.5,5)g·kg^(-1),氟西汀组ig盐酸氟西汀0.01 g·kg^(-1),正常组和模型组ig等体积生理盐水,每日1次,持续干预21 d。干预期间,各造模组大鼠均继续给予刺激。通过糖水偏好和旷场实验评估CUMS模型大鼠抑郁状态;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血浆促肾上腺皮质激素释放激素(CRH),促肾上腺皮质激素(ACTH),皮质酮(CORT)及海马匀浆中BDNF,5-HT水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测海马TrKB,5-HT1AR,糖皮质激素受体(GR)和盐皮质激素受体(MR)mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马TrKB,5-HT1AR,GR,MR蛋白表达水平;苏木素-伊红(HE)染色观察海马组织形态学变化。结果:与正常组比较,模型组大鼠糖水偏好率显著下降(P<0.01),旷场实验中水平得分和垂直得分显著降低(P<0.01),血浆CRH,ACTH,CORT含量显著升高(P<0.01),海马BDNF,5-HT含量显著降低(P<0.01),海马TrKB,5-HT1AR和GR mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.01),MR mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01),HE染色结果显示海马神经元结构损伤。与模型组比较,四逆散低、中、高剂量组和氟西汀组糖水偏好率显著升高(P<0.01),旷场实验中水平得分和垂直得分明显升高(P<0.05,P<0.01),血浆CRH,ACTH,CORT含量明显降低(P<0.05,P<0.01),海马BDNF,5-HT含量明显升高(P<0.05,P<0.01),海马TrKB,5-HT1AR和GR mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),MR mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01),HE染色结果显示海马神经元结构明显复原。结论:四逆散具有显著的抗抑郁作用,其机制可能与升高大鼠海马BDNF,5-HT含量,上调TrKB,5-HT1AR和GR mRNA及蛋白表达水平,下调MR mRNA及蛋白表达水平,抑制HPA轴亢进,增强海马组织神经元的再生和修复相关。