C端非催化结构域对嗜热α-葡聚糖磷酸化酶TsGP酶学性质的影响

为获得异源表达水平与酶学性质良好的α-葡聚糖磷酸化酶并考察结构域对酶的影响,研究通过数据库挖掘和序列分析,获得了来源于超级嗜热古菌Thermococcus sp.EP1的新型α-葡聚糖磷酸化酶TsGP。利用AlphaFold2预测三维结构确定TsGP的C端为非催化结构域后,构建了C端截短的突变体ΔTsGP。在E.coli BL21(DE3)中对TsGP与ΔTsGP进行异源重组表达,并对其酶学性质进行了表征。结果表明,ΔTsGP在大肠杆菌中的表达水平较TsGP提高了3.76倍。在最适反应温度为70℃时,ΔTsGP的比酶活为23.87 U/mg,较TsGP提高1.3倍。在50~65℃的工业酶催化条件下,ΔTsGP的热稳定性与TsGP相当,且酶活力更高。此外,ΔTsGP与TsGP具有相同的底物特异性,最小底物为麦芽三糖,且随着底物链长的增加,比酶活逐渐提升。以麦芽七糖为底物,ΔTsGP的kcat值为37.09 s^(−1),比TsGP提高了1.21倍,但底物亲和力(K_(m)=3.30 mmol/L)降低了2.77倍。研究通过结构分析与非催化结构域截短策略成功提高了TsGP在大肠杆菌中的表达水平和工业酶催化条件下的比酶活。这为αGP酶蛋白的高效表达与应用提供了借鉴,并为进一步通过工程改造优化其性能奠定了基础。

纤维二糖磷酸化酶表达条件的优化及其酶学性质研究

纤维二糖磷酸化酶(cellobiose phosphorylase,CBP)磷酸化裂解纤维二糖为葡萄糖-1-磷酸,它是木质纤维素转化淀粉的关键酶。该研究将来源于Clostridium thermocellum YM4的cbp基因通过表达载体pET-28a(+)构建重组菌Rosetta(DE3)/pET-28a-CBP用于表达CBP。对其诱导表达条件进行优化,结果显示当诱导温度、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)浓度和诱导时间分别为15℃、0.2 mmol/L和12 h时CBP酶活力最高,为0.47 IU/mL。进一步利用Ni柱分离纯化出带有His标签的CBP,结果表明该重组酶分子质量为95 kDa,比酶活1.03 IU/mg;最适反应温度60℃,最适反应pH 6,半失活时间为60 min;金属离子Cu^(2+)显示出对该酶有强烈的抑制作用,然后依次是Zn^(2+)、Fe^(3+)、Ca^(2+)、Mn^(4+)(P<0.05);而K^(+)、Mg^(2+)和Na^(+)对该酶活力无显著性影响(P>0.05);最后对重组CBP的动力学参数进行了表征,K_(m)值为19.61μmol/mL,V_(max)值为1.19μmol/(mL·min)且K_(cat)值为21.38 s^(-1)。

低温胁迫下草菇海藻糖磷酸化酶基因表达变化研究

海藻糖是真菌抵御逆境的重要渗透调节物质之一,其合成与分解受海藻糖磷酸化酶(trehalose phosphorylase,TP)调控。以草菇低温敏感型菌株V23和耐低温型菌株VH3为试验材料,研究了低温胁迫对草菇海藻糖磷酸化酶基因的影响,并比较了海藻糖磷酸化酶基因在两个菌株中的转录表达差异。实时荧光定量RT-PCR结果显示:耐低温型菌株VH3的TP基因在低温处理2 h时表达量升高,此后逐渐下降,低温敏感型菌株V23的TP基因在整个低温处理过程中一直呈下降趋势,并且在相同低温处理时间下,该基因在VH3中的表达量下降幅度要小于V23中的。初步推测TP基因的高表达与草菇的耐低温能力相关。

一种高温细菌葡聚糖磷酸化酶基因的克隆与表达

葡聚糖磷酸化酶(GlgP)在生物体的糖代谢过程中具有中心地位的作用。腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermo-anaerobacter tengcongensis MB4T=AS.1.2430T=JCM11007T)分离自云南腾冲的温泉,其最适生长温度为75℃。为研究腾冲嗜热厌氧杆菌的葡聚糖磷酸化酶(Tte-GlgP)的性质,试验以T.tengcongensis MB4T的全基因组为模板,通过PCR扩增得到MB4T中的编码GlgP的基因(glgp),将其克隆到表达载体pET23b上,经过PCR验证、酶切验证和测序验证正确后,转化到宿主细胞大肠杆菌BL21DE3中,成功得到了表达。通过SDS-PAGE电泳分析得到其分子量约为64ku,与预期的结果一致。试验为Tte-GlgP性质的进一步研究和应用构建了基因工程菌株。

一种高温细菌葡聚糖磷酸化酶的性质研究(Ⅰ)

为了研究极端嗜热细菌腾冲嗜热厌氧杆菌葡聚糖磷酸化酶(Tte-GlgP)的性质,将用大肠杆菌BL21DE3表达的Tte-GlgP进行了纯化,分别用SDS-PAGE电泳法及毛细管电泳法测定了分子量及等电点,结果表明,Tte-GlgP的分子量约为64kDa,等电点约为6.2,与推测的结果一致,说明Tte-GlgP在大肠杆菌体内可能得到了正确的折叠;WESTERN杂交试验的结果表明,Tte-GlgP在腾冲嗜热厌氧杆菌体内有表达,且终浓度为1.5%的麦芽糖能轻度诱导Tte-GlgP在腾冲嗜热厌氧杆菌体内的表达,而终浓度为1.5%的葡萄糖则轻度抑制Tte-GlgP在腾冲嗜热厌氧杆菌体内的表达,说明Tte-GlgP在腾冲菌体内可能参与了碳水化合物的代谢。本研究为进一步认识和应用Tte-GlgP提供了依据。

海栖热袍菌极耐热纤维二糖磷酸化酶在大肠杆菌中的克隆和表达

将来源于极端嗜热菌属海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的编码纤维二糖磷酸化酶的结构基因cepA与新型热激质粒pHsh连接,得到重组质粒pHsh-cepA。将重组质粒pHsh-cepA转入大肠杆菌JM109进行表达。SDS-PAGE结果显示,该重组酶的分子量为90kD,与理论值相符。基于热激载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性非常好。这对该酶的大规模发酵应用具有重要意义。

海藻糖高产株Brevibacterium sp SY361海藻糖磷酸化酶(EC2.4.1.64)的纯化

目的研究分离纯化海藻糖高产株Brevibacterium sp SY361中海藻糖磷酸化酶的工艺,获得高纯度的海藻糖磷酸化酶。方法大量培养细菌Brevibacterium sp SY361,超声粉碎细胞,通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-SephadexA-25柱层析和Sephadex G-200凝胶过滤等步骤纯化其海藻糖磷酸化酶,并通过SDS-PAGE检测纯化效果。结果经纯化后的海藻糖磷酸化酶纯度提高了35.6倍,比活力达到7.48U/mg,SDS-PAGE呈1条带。结论纯化后的海藻糖磷酸化酶已达到纯度要求,可用于酶性质的研究。

乙酸菌糖磷酸化作用的研究

对７ 种乙酸菌（ Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｒｕ ｍｉｎｉｓ， Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ， Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ ｌｉｍｏｓｕ ｍ 和分离株Ａ２ 、Ａ４ 、Ａ１０ 、Ｈ３ＨＨ） 的葡萄糖和２脱氧葡萄糖磷酸化作用进行了研究。尽管所有机体都存在磷酸化反应，但它们在依赖ＰＥＰ 和ＡＴＰ 的比例上有实质性区别。分离菌株Ａ１０ 具有最高的依赖ＰＥＰ 的葡萄糖磷酸化活力（１１６２ｎｍｏｌ·Ｌ－１·ｍｇ － １·ｍｉｎ － １） ，Ａ１０ 、Ｈ３ＨＨ和Ｅ．ｌｉｍｏｓｕｍ 都具有葡萄糖磷酸转移酶系统（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ，ＰＴＳ） 。相反，Ａ．ｒｕｍｉｎｉｓ、Ａ．ｗｏｏｄｉｉ、Ａ２ 和Ａ４ 则不具有ＰＴＳ活力。这七株菌的葡萄糖依赖ＡＴＰ 的磷酸化活力都高于依赖ＰＥＰ的磷酸化活力，但其程度有所不同。Ａ１０ 和Ｈ３ＨＨ 的葡萄糖ＰＴＳ可通过胞外葡萄糖诱导，并且其比活在对数期随培养时间延长而增加。此外，还检测到Ａ１０

重组Pyrococcus furiosus葡聚糖磷酸化酶催化淀粉合成葡萄糖-1-磷酸

将Pyrococcus furiosus来源的编码葡聚糖磷酸化酶的glg P基因进行稀有密码子优化,在E.coli中重组表达并催化淀粉合成G-1-P。在反应条件优化基础上,以不同的淀粉为底物,GPase均表现出较强的催化能力。在原料预处理、高浓度底物催化及补料催化研究的基础上,以7.5%玉米淀粉为初始底物,反应16 h后补入2.5%玉米淀粉,继续反应32 h,G-1-P产量达250.34 mmol·L^(-1),底物转化率达65.1%,与相同浓度的可溶性淀粉相比,G-1-P产量及转化率(252.9mmol·L^(-1),65.9%)均相近,表明廉价易得的玉米淀粉可以代替可溶性淀粉为原料生产G-1-P,大幅降低G-1-P生产的原料成本。

牛瘤胃产纤维二糖磷酸化酶细菌的筛选及产酶条件研究

为了获得产新型纤维二糖磷酸化酶(CBP)的菌株,利用选择性培养基从牛瘤胃液中逐步分离纯化,筛选能以纤维二糖为唯一碳源生长的菌株,分别检测所筛选菌株的β-葡萄糖苷酶(βG)和CBP活力,并对其纤维二糖的利用方式(水解途径或磷解途径)进行鉴定,获得产CBP的菌株,命名为BY-a。采用形态学观察、生理生化试验,结合16S r DNA序列分析,鉴定菌株BY-a为克雷伯氏菌属(Klebsiella)。对菌种产CBP的温度、时间、最适装液量和溶氧量进行初步优化,结果显示,BY-a菌株在装液量为30mL(250mL)、37℃振荡培养24 h时,产CBP活力最高。

化学分子伴侣及诱导条件协同强化Thermotoga maritimaα-葡聚糖磷酸化酶可溶性表达

为实现海栖热袍菌Thermotoga maritimeα-葡聚糖磷酸化酶的高效制备。构建了产α-葡聚糖磷酸化酶重组菌株,并对发酵条件进行了优化。初步研究发现,重组菌株在37℃条件下进行诱导培养,摇瓶发酵24 h,酶活力仅有5.2 U/mL;SDS-PAGE蛋白电泳显示,重组酶主要以不可溶的包涵体状态存在,可溶性酶所占比例偏低。为减少包涵体的形成、提高重组酶可溶性表达水平,分别从诱导条件和分子伴侣两个方面进行了优化。首先,通过对诱导剂种类、诱导剂浓度、温度、诱导剂添加时间等诱导条件进行优化后,α-葡聚糖磷酸化酶的酶活力提高到27.0 U/mL,是优化前的5.2倍。其次,通过添加化学分子伴侣进一步提高重组酶可溶性表达水平,发现在发酵0 h添加20 mmol/L的化学分子伴侣(肌醇)后,最高酶活力为62.0 U/mL,是优化前酶活力的11.9倍;然而,共表达5种分子伴侣质粒pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16对α-葡聚糖磷酸化酶的可溶性表达均没有促进作用。

二糖磷酸化酶及其在体外合成生物学中的应用

二糖磷酸化酶是以二糖为底物,催化磷酸向糖基转移,生成糖1-磷酸的一类酶。根据催化反应的立体化学过程可以分为保留型和翻转型,即供体底物二糖的异头构型可以在糖1-磷酸产物中保留或翻转。目前已发现的超过10种的二糖磷酸化酶均分布在糖苷水解酶和糖苷转移酶家族中。根据二糖磷酸化酶的功能设计体外生物合成体系,不仅可以用于制备高价值化学品,例如直链淀粉、肌醇、昆布二糖等,还可生产一些大宗产品,例如在氢能和酶燃料电池开发等方面已取得了进展。随着蛋白质工程的不断发展,对二糖磷酸化酶的研究越来越深入,相信未来二糖磷酸化酶将在体外生物合成平台扮演更重要的角色。

纤维二糖磷酸化酶和纤维寡糖磷酸化酶的研究与应用

自然界中一些厌氧的纤维素降解菌能够产生纤维二糖磷酸化酶(Cellobiose Phosphorylase,CBP)和纤维寡糖磷酸化酶(CellodextrinPhosphorylase,CDP)磷酸化裂解纤维二糖和纤维寡糖。CBP和CDP属于糖苷水解酶94家族(Glycoside Hydrolase Family 94,GH94),对β-1,4糖苷键高度专一。目前已广泛研究了不同来源的CBP和CDP的功能性质和催化机理,并通过蛋白质晶体结构分析揭示了二者采用不同聚合度纤维寡糖作为底物的结构基础。因CBP和CDP可催化独特的磷酸化裂解反应和逆向合成反应,已有多篇报道显示CBP和CDP在生产实践上的应用,主要在构建直接利用纤维寡糖的工程酵母菌、构建酶法纤维素转淀粉体系和酶法合成特殊糖类等3个方面。由于对CBP和CDP的持续关注,在此对二者的相关研究进行综述,并提出今后的研究重点。

乳二糖磷酸化酶的表达优化

为了提高目的蛋白的产量和活性,将克隆自Bifidobacterium longum JCM1217的乳二糖磷酸化酶(LNBP)的基因构建到大肠杆菌BL21中,优化其表达条件。结果显示,诱导时间、诱导温度及IPTG浓度对LNBP的表达水平影响显著。经正交试验,优化出的重组菌表达LNBP的最佳诱导条件为诱导温度30℃, IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导时间18 h。在此条件下获得的LNBP比活力达到15.18 U/mg。

HPLC示差折光法测定水产品中还原糖、磷酸化单糖和蔗糖

以市售淡水鱼为试材,建立水产品中还原糖（葡萄糖、核糖）、磷酸化糖（磷酸化核糖和磷酸化葡萄糖）和蔗糖的定性、定量检测方法。对鱼肉中各糖进行检测,建立鱼肉中糖的高效液相示差折光分析法检测法。将鱼肉分成背部肌肉和腹部肌肉两个部分,用乙醇/水提取鱼肉中各糖物质,经树脂吸附处理后,对鱼肉中各糖物质进行分析。磷酸化糖检测,首先用碱性磷酸酶脱磷酸化,然后用同法进行检测。结果显示：各糖物质分离效果较好,方法学验证,各物质线性关系良好,回收率在70.2%~98.5%之间,重复性RSD均小于5%。

香蕉α-1,4-葡聚糖淀粉磷酸化酶基因家族全基因组鉴定与进化分析

为了研究香蕉(Musa nana Lour.)α-1,4-葡聚糖淀粉磷酸化酶(α-1,4-glucan starch phosphorylase,PHS)基因家族的特征和功能,利用生物信息学方法对香蕉PHS家族进行了全基因组查找、鉴定及相关分析。结果表明,在香蕉中共鉴定出2个成员,Ma PHS1的开放阅读框长度为2 784 bp,编码927个氨基酸,分子质量为104.8 ku,等电点为6.59;Ma PHS2的开放阅读框长度为2 517 bp,编码838个氨基酸,分子质量为95.09 ku,等电点为6.09。Ma PHS1和Ma PHS2分别含有17个和15个外显子;Ma PHS1和Ma PHS2均含有淀粉磷酸化酶的保守性基序,进化过程中比较保守。

ELISA法测定糖原磷酸化酶同工酶BB

目的 建立ELISA法测定糖原磷酸化酶同工酶BB的方法。方法 从心肌中纯化糖原磷酸化酶同工酶BB,制备单克隆抗体,以双抗体夹心ELISA法测定GPBB酶蛋白含量。结果 方法线性可达100μg/L,平均回收率为102％±2.4％,低值和高值的批内、批间变异分别为5.1％,7.4％和6.2％,10.4％。参考值范围为1.05-6.53 μg/L。AMI诊断域值为7.9 μg/L。结论GPBB方法简便、快速,适于临床应用,是AMI早期诊断的敏感指标。

磷酸化海藻糖制备工艺优化及其活性评价

目的探究磷酸化海藻糖制备的最佳工艺参数,并以冻藏南美白对虾为对象,评价磷酸化海藻糖对冻藏虾仁水分保持特性的影响。方法通过单因素实验和正交实验,对海藻糖磷酸化制备条件进行优化设计,考察磷酸化试剂配比、海藻糖浓度、反应温度和时间对磷酸化海藻糖对冻藏虾仁保水效果的影响。通过钼蓝比色法测定磷含量,并利用红外光谱进行磷酸化海藻糖结构分析。结果最佳磷酸化条件为磷酸盐配比(三聚磷酸钠:三偏磷酸钠)6:1,海藻糖浓度6%,反应温度90℃和反应时间7 h。磷酸化条件对冷冻南美白对虾解冻损失率的影响强度依次为磷酸盐配比=海藻糖浓度=反应温度>反应时间。结论在此条件下,制备的磷酸海藻糖处理南美白对虾,相比于单纯海藻糖处理,虾仁解冻损失率更小,磷酸化海藻糖中磷酸根含量为11.68%。可为冷冻水产品低糖低磷保水剂生产与开发提供研究方向。

磷酸化甘露聚糖可促进断奶猪生长

美国研究人员通过试验证实．在断奶猪日粮中添加0.3％磷酸化甘露聚糖可以显著提高平均日增重和增重饲料比．并且可以调节猪的免疫功能。

以蔗糖为底物双酶法合成直链糊精

选用蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶合成直链糊精,并对工艺条件进行优化。以蔗糖为底物,在添加磷酸盐的条件下,蔗糖磷酸化酶催化反应,生成中间产物葡萄糖-1-磷酸,选用液质联用仪鉴定葡萄糖-1-磷酸的产生;加入麦芽四糖作引物,葡聚糖磷酸化酶催化合成直链糊精,用高效离子交换色谱分析终产物直链糊精的聚合度分布。通过单因素实验,分别研究酶浓度、反应时间、pH及温度对两步反应的影响。蔗糖磷酸化酶催化生成中间产物葡萄糖-1-磷酸的优化工艺条件为:酶浓度4.0 U/mL、反应时间4 h、pH 6.5、温度40℃;葡聚糖磷酸化酶催化合成直链糊精的优化工艺条件为:酶浓度5.0 U/mL、反应时间4 h、pH 4.5、温度40℃。