传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达

将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒 (ILTV)糖蛋白gB基因 ,通过EcoRI位点亚克隆到杆状病毒转移载体pVL1393中 ,构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB。将rpVLgB转移载体质粒与杆状病毒DNA(Bac_N_BlueDNA)共转染Sf9昆虫细胞 ,经 3轮蚀斑纯化 ,获得重组病毒并命名为rpVL_ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中 ,直接免疫荧光试验和Dot_ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得表达 ,表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。

鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗株糖蛋白gB基因序列比较分析

根据已经发表的鸡传染性喉气管炎病毒 ( ILTV) SA2 株的 g B基因序列 ,设计了 1对引物 ,通过 PCR扩增了 ILTV王岗株的 g B基因 ,并克隆到 p UC1 1 9质粒的 Eco R 位点中 ,经酶切鉴定证实后 ,进行了序列测定。结果表明 ,g B基因长 2 6 1 9bp,包含完整的阅读框架。序列比较分析表明 ,ILTV王岗株的 g B基因核苷酸序列与英国的 Throne882和美国的 6 32 2个强毒株的 g B基因序列完全一致 ,而与澳大利亚 SA2 疫苗株g B基因核苷酸同一性为 99.8% ,氨基酸的同一性为 98.4 %。与澳大利亚 SA2 疫苗株 g B基因核苷酸和氨基酸序列比较发现 ,ILTV 3个强毒株 (王岗株 ,Throne 882株和 6 32株 ) g B基因的核苷酸序列在第 89位上均缺失 1个碱基 G,而在第 1 0 2位核苷酸处又插入了 1个碱基 A,从而引起了在氨基酸序列中第 2 9～ 32位 5个氨基酸的移码突变。

人巨细胞病毒糖蛋白gB基因重组腺病毒载体的构建及包装

目的构建携带有人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白gB基因的重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中进行包装。方法将gB基因克隆至穿梭质粒Track-CMV,构建重组质粒Track-CMV/gB,亚克隆至转移载体pAD-Easy-1,构建重组质粒pAD-Easy-1/gB,将该重组骨架质粒转染HEK293细胞,利用HEK293细胞产生重组腺病毒。空斑法及PCR法挑选重组病毒,荧光显微镜观察标志蛋白(绿色荧光蛋白)的表达,利用噬斑法检测病毒滴度。结果重组腺病毒载体经酶切鉴定证明构建正确,转染重组腺病毒载体的HEK293细胞经PCR扩增,可见约700bp的目的基因片段,荧光显微镜观察可见绿色荧光蛋白表达,空斑试验检测病毒滴度为2×106PFU/ml。结论已成功构建了含有gB基因的重组腺病毒载体,为进一步研制重组腺病毒载体HCMV疫苗提供了条件。

鸡传染性喉气管炎病毒中国王岗株糖蛋白gB基因克隆及鉴定

以ＰＵＣ１９质粒为载体构建了鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＥｃｏＲＩＤＮＡ文库。根据已经发表的澳大利亚ＩＬＴＶ－ＳＡ２株和英国ＩＬＴＶ－Ｖ８２２株的糖蛋白ｇＢ基因的核苷酸序列，设计并合成了一对引物，以ＩＬＴＶ中国王岗株ＤＮＡ为模板，扩增出１．３３８ｋｂ的糖蛋白ｇＢ基因片段，用ＤＩＧ标记制备成核酸探针，从ＩＬＴＶＥｃｏＲＩＤＮＡ文库中筛选出阳性重组子，得到一个ＥｃｏＲＩ３．０ｋｂ的ＩＬＴＶＤＮＡ片段。经酶切分析表明，该３．０ｋｂＩＬＴＶＤＮＡＥｃｏＲＩ片段含有完整的糖蛋白ｇＢ基因，经ＰＣＲ和核酸杂交表明所克隆的糖蛋白ｇＢ基因是特异的。

鸡马立克氏病病毒糖蛋白gB基因的表达及基因免疫

将马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)gB基因插入真核表达载体pcDNA3中,经酶切和PCR鉴定为正向插入了gB基因的重组质粒,命名为pcDNA3-gB。体外转染COS-7细胞,经间接免疫荧光染色证实转染pcDNA3-gB后的COS-7细胞内有糖蛋白B的表达。用pcDNA3-gB对AA肉用雏鸡腿部肌肉注射,进行一免。间隔2周后,用pcDNA3-gB再加强免疫一次。之后2周攻毒,观察免疫保护效果。结果表明,MDV gB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护,免疫保护指数为72.2％。

传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中的表达

本试验首先用PCR方法扩增出ILTVgB基因 ,将其克隆到质粒pUC1 1 9中 ,并进行了序列分析。将克隆的gB基因再亚克隆到禽痘病毒转移载体质粒中 ,然后 ,通过质脂体方法转染由禽痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中 ,筛选蓝色的重组病毒 ,并对其进行了 6轮蚀斑纯化。该重组病毒通过PCR方法鉴定证明其基因组中含有完整的鸡传染性喉气管炎gB基因 。

巨细胞病毒糖蛋白B基因型与新生儿感染关系研究

目的:探讨感染新生儿人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白B(gB)基因型分布,研究不同HCMV gB基因型致病性的差异。方法:采用巢式聚合酶链反应(nested PCR),限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术等测定88例感染患儿尿中HCMV gB基因型,并分析gB基因型与不同临床症状的关系。结果:感染新生儿HCMV 4个gB基因型分布为gB1型占48%,gB2型占27%,gB3型占18%,gB4型占7%。不同gB基因型HCMV感染的临床表现存在差异。结论:4个gB基因型HCMV均能引起新生儿感染,以gB1型为主。不同HCMV gB型感染可导致不同的临床结果。

共表达MDV糖蛋白B和鸡γ干扰素基因的重组鸡痘病毒的构建

Recombinant fowlpox viruses(rFPVs)coexpressing MDV gB and chicken type Ⅱ interferon (IFN-Ⅱ) gene were constructed by using different promoters of Ps and PE/L.rFPVs were selected and purified by blue plaque expressing β-galactosidase.The expression of MDV gB gene was confirmed by indirect immunofluorescence assay.The levels of MDV gB expressed in rFPV-gB-IFN under the control of the synthetic promoter Ps was same as that in rFPV-gB.The expression of IFN-Ⅱ was examined in chicken embryo fibroblast(CEF) by protection against vesicular stomatitis virus-induced cytopathic effect.The levels of IFN expressed in CEF was 640～1280 units/mL.When rFPVs were propagated in CEF,the plaque sizes of rFPV-gB were larger than those of rFPV-gB-IFN,the plaque formation units of rFPV-gB were also more than those of rFPV-gB-IFN.

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B基因疫苗的初步免疫学研究

目的利用构建成功的重组真核表达质粒pgB免疫小鼠,探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSVⅠ-)gB基因作为基因疫苗的可能性。方法用重组真核表达质粒pgB免疫小鼠,通过中和试验、ELISA方法检测pgB接种小鼠的免疫效果,并对免疫的小鼠进行病毒攻击。结果实验小鼠产生了对HSV-1特异性的抗体(抗体滴度:ELISA法1∶273,中和试验法:1∶49),实验组中和效价显著高于载体对照组和阴性对照组(P<0.01);对病毒的攻击并有免疫保护作用,实验组和空白对照组比较(P<0.01)。结论证明pgB真核表达质粒,具有DNA疫苗作用,可在小鼠体内诱发保护性免疫反应,pgB有可能作为基因疫苗用于单纯疱疹病毒性角膜炎预防和治疗,为进一步构建单纯疱疹病毒糖蛋白联合疫苗并最终用于单疱病毒角膜炎奠定了理论基础。

表达马立克氏病病毒CVI988/Rispens株糖蛋白B基因的重组鸡痘病毒疫苗的免疫保护研究

用鸡痘病毒载体表达马立克氏病病毒 (MDV)糖蛋白B(gB)基因构建成重组鸡痘病毒 (rF PV)。以MDVGA或Md5和RBIB混合攻毒 ,在不同品种的鸡中评价rFPV -gB/R单价苗和与火鸡疱疹病毒 (HVT)组成的二价苗的免疫保护效力。试验结果表明 ,MDV疫苗和FPV母源抗体阴性的SPF鸡和母源抗体阳性的商品鸡中 ,rFDV - gB/R均能提供免疫保护作用 ,且其中一种商品蛋鸡中rFPV - gB/R与HVT液氮苗或HVT冻干苗结合使用 ,均有显著的免疫协同保护作用。免疫学研究指出 ,rFPV -gB/R与常规疫苗一样 ,可显著地降低疫苗免疫攻毒鸡的病毒血症和羽囊排毒。

人类免疫球蛋白超家族一个新成员:α-1B糖蛋白前体基因的克隆和分析

应用RACE方法 ,从人肝MarathoncDNA中克隆一 16 94bp的cDNA ,其中开放阅读框架在 4 3～ 15 30bp ,编码 4 95个氨基酸 ,1～ 17氨基酸为信号肽 ,有 4个IGc2结构域 ,与从人血浆分离的α 1B糖蛋白高度同源 ,是一个尚未克隆的α 1B糖蛋白前体基因 ,属于免疫球蛋白超家族的一个新成员 。

真核质粒IL-2协同单纯疱疹病毒糖蛋白B基因疫苗免疫作用的研究

目的:探讨IL-2真核表达质粒(pcIL-2)协同单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白B(gB)基因疫苗(pgB)对机体免疫应答的作用。方法:利用已构建具有生物活性的IL-2真核表达质粒(pcIL-2)及单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白B(gB)真核表达质粒(pgB)免疫小鼠,通过双侧股四头肌多点注射免疫BALB/c小鼠,共重复接种3次,每次间隔2周;末次免疫4周后取血进行检测。通过中和试验、ELISA、耳廓肿胀实验检测迟发型超敏反应(DTH)方法检测pgB质粒单独免疫和pcIL-2质粒协同免疫诱导产生的免疫效果,并通过病毒攻击实验观察各组小鼠的生存情况。结果:与pgB单独免疫相比,pcIL-2的协同免疫使实验小鼠对HSV-1特异性抗体的产生显著增加,明显增强了对病毒的攻击免疫保护作用。结论:pcIL-2基因佐剂可提高pgB基因疫苗的免疫水平,全面增强小鼠对核酸疫苗的免疫应答,增强基因疫苗对机体的免疫保护效果。

含有马立克氏病病毒糖蛋白B基因重组质粒的构建及其鉴定

将马立克氏病病毒(MDV)GA 株基因文库中 BamH I I_3和 K_3克隆片段分别用 BamH I 加 Sal I 和 BamH I加 EcoR I 双酶切消化。含有编码 MDV 糖蛋白 B(gB)部分 DNA 的2.B kb、BamH I-Sal I 片段和1.1kb、BamH I-EcoR I 片段与 Sal I-EcoR I 消化的载体 pUR 222通过三聚体连接方式相连接。限制性核酸内切酶分析表明,重组质粒含有 MDV gB 基因,并且 MDV GA 株 gB 基因克隆在 EcoR I,Hind,Ⅲ,Xba I 和 Sal I 切点与 MDVRBIB 株相同。

马疱疹病毒1型gB糖蛋白表位与小鼠C3d串联重组质粒免疫效果分析

为了探究马疱疹病毒1型gB糖蛋白表位与小鼠C3d串联重组质粒的免疫效果。设计合成完整的抗原表位串联体B;以小鼠脾脏总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增出小鼠C3d基因;以EHV-1基因组为模板扩增出gB基因;构建重组质粒B-pVAX1、gB-pVAX1、C3d-pVAX1、B-C3d-pVAX1和gB-C3d-pVAX1;转染BHK-21细胞后能正常表达;将重组质粒免疫BALB/c雄性小鼠。结果表明:B-pVAX1免疫组抗体水平、IFN-γ和IL-4相对表达量均高于gB-pVAX1免疫组、C3d-pVAX1免疫组和对照(PBS)免疫组,差异极显著(P<0.01);B-C3dpVAX1免疫组抗体水平、IFN-γ和IL-4相对表达量均高于B-pVAX1免疫组、C3d-pVAX1免疫组和对照(PBS)免疫组,差异极显著(P<0.01);gB-C3d-pVAX1免疫组抗体水平、IFN-γ和IL-4相对表达量均高于gB-pVAX1免疫组、C3d-pVAX1免疫组和对照(PBS)免疫组,差异极显著(P<0.01);重组表位串联体B能够增强小鼠体液免疫和细胞免疫,同时C3d作为分子佐剂具有增强免疫的作用。

血小板膜糖蛋白Ⅰbα基因多态性与脑卒中关系的研究

目的探讨血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰbα基因多态性与脑卒中的发生关系。方法收集300例经CT和(或)MRI检查证实的脑卒中病人,其中脑梗塞200例,脑溢血100例,并收集300例与脑卒中组的年龄、性别相匹配的无脑血管疾病人群作为对照组,采用聚合酶链反应限制性片段多态性(PCRRFLP)方法检测研究对象GPⅠbα基因145Thr/Met变异。结果脑卒中组血小板GPⅠbα基因145Thr/Met突变率显著高于对照组(17.33%比14%,P=0.003,OR=3.33,95%Cl为1.29～5.38)。脑梗塞组GPⅠbα145Thr/Met突变率是21.5%,其对照组为14%,两组比较差异有显著性(P<0.01,OR=7,95%Cl为3.43～10.57)。脑溢血组GPⅠbα145Thr/Met突变率与对照组比较差异无显著性(P=0.158)。结论GPⅠbα145Thr/Met变异与脑梗塞的发生相关,但与脑溢血关系不明显。

先天性心脏病患儿体内人巨细胞病毒糖蛋白B基因型研究

目的探讨HCMV感染和gB基因型与先天性心脏病关系。方法2004年9月～2005年6月住院的先天性心脏病患者116人为先心组,其中仅患先天性心脏病者73人,合并肺炎43人,其中男性64人,女性52人,年龄1个月～13岁,平均(1.7±2.0)岁。对照Ⅰ组为同期住院无先天性心脏病而仅患肺炎的患者98人,其中男性57人,女性41人,年龄1个月～14岁,平均(2.3±3.3)岁。对照Ⅱ组为无症状正常婴儿但尿HCMV—DNA检测为阳性,共25人,年龄1个月～12月,平均(6.9±5.3)月。应用荧光定量法检测先心组和对照Ⅰ组尿HCMV—DNA含量,应用套式PCR(nPCR)加限制性长度多态性分析(RFLP)的方法检测HCMV包膜糖蛋白B(glycoprotein B,gB)基因型。结果先心组尿HCMV—DNA阳性率60.3%,对照Ⅰ组尿HCMV—DNA阳性率36.7%,差异有统计学意义(X^2=11.864,P<0.01);年龄1～12月先心患儿体内HCMV gBⅠ型占78.6%(22/28),对照Ⅱ组HCMV gBⅠ型占40.0%(10/25),差异有统计学意义(X^2=8.214,P<0.01)。结论宫内HCMV感染可能是先天性心脏病的致畸因子,gBⅠ型是致病优势基因。

马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中的表达

将马立克氏病病毒gB基因用EcoRⅠ从质粒pUR MDVEgB中切下。两端补平后,插入到质粒pEFgpt12s的PstⅠ酶切位点。构建了含有完整的MDVgB基因的转移载体pEFgpt12s gB。这个载体的特点是,它含有两个启动子,在强的复合启动子Spromoter的下游是插入的gB基因,另一个反向启动子vvP7 5的下游是标记基因Ecogpt,它的两端是FPV的非必需区。携带gB基因的质粒pEFgpt12s gB通过磷酸钙的方法转染用282E4株FPV感染3 4h的鸡胚成纤维细胞。通过药物筛选,得到含有gB基因的重组病毒。通过PCR、免疫荧光检测,证实了重组病毒中含有gB基因,并且gB糖蛋白也得到了表达。

血小板糖蛋白Ⅱb／Ⅲa的P1^A基因多态性与心肌梗死关系的研究

目的 对血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的P1A 基因多态性与心肌梗死 (AMI)的关系进行探讨。方法 运用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性分析 (PCR -RFLP)技术检测 6 4名AMI患者及 4 7名健康对照者GPⅡb/Ⅲa的P1A 的基因多态性。结果 所有患者和正常对照者均为P1A1/A1基因型 ,P1A2 基因型的检出率为 0 %。结论 血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的P1A 的基因多态性与中国人群AMI危险度的增加无关。在中国汉族人群中P1A2 基因型分布是极低的 。

血小板膜糖蛋白GPⅠb基因VNTR多态性与脑梗死的关系

①目的 探讨GPⅠb基因VNTR多态性等位基因和基因型在中国青岛地区汉族人群中的分布规律 ,并深入研究这种多态性与脑梗死的关系。②方法 采用病例对照研究 ,选择 10 5例经脑CT或MRI确诊的脑梗死病人作为脑梗死组 ,10 0例健康者作为对照组 ,用PCR法对全部受试者进行GPⅠb基因VNTR多态性检测。③结果 脑梗死组B等位基因频率和BC基因型频率均明显高于对照组 (χ2 =5 .16 2、4 .386 ,P <0 .0 5 )。Logistic回归分析结果显示B等位基因与脑梗死有相关性 (OR =5 .10 ,P =0 .0 4 6 ,95 %CI为 0 .96～ 2 7.15 )。④结论 血小板膜糖蛋白GPⅠb基因VNTR多态性与缺血性脑血管病有相关性 ,B等位基因和BC基因型可能是脑梗死的致病危险因素。