猪瘟病毒糖蛋白E0基因的克隆及其表达研究

用ＲＴ－ＰＣＲＡ法扩增分别获得了中国猪瘟病毒强毒石门株和免化弱毒株糖蛋白Ｅ０基因ｃＤＮＡ，并克隆到ｐＧＥＭ Ｔ载体中测定其核着酸序列和推导出其对应氨基酸序列；结果表明这两个毒株间的Ｅ０基因核着酸序列同源性为９５．３％，氨基酸序列同源性为９４％，有１４个残基的差异；与几个代表毒株ＡＬＤ株、ＧＰＥ株、Ｂｒｅｓｃｉａ株、Ａｌｆｏｒｔ株和国外测得的免化弱毒Ｃ株相应序列进行比较，所测石门病毒核苷酸序列与上述各株对应序列的同源性分别为９８．０％、９７．１％、９２．７％、８６．８％和９５．４％；氨基酸序列同源性分别为９７．４％、９６．１％、９５．３％、９２．７％和９４．４％；所测兔化弱毒核着酸序列与上述各株对应序列的同源性分别为９５．２％、９４６％、９１．３％、８５．１％和９９．０％；氨基酸序列同源性分别为９３．１％、９２．３％、９１．４％、９０．５％和９８．７％；氨基酸序列分析结果还表明：上述各株病毒糖蛋白Ｅ０序列均含有与地衣类及植物核苷酸酶同样保守的两个氨基酸基序ＳＬＨＧＩＷＰＸ（Ｘ为Ｇ或Ｅ）和ＥＷＮＫＨＧＷＣ，基序中Ｈ为ＲＮａｓｅ催化活性关键氨基酸残基；将上述Ｅ０基因亚克隆至真核表达载体ｐＥＧＦＰ－Ｃ１。

表达猪瘟兔化疫苗株E0蛋白的PK-15细胞系构建

将克隆到pGEM T-easy载体中的E0基因双酶切回收后,连接到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)中,利用Lipofectami-neTM2000将重组子转染PK-15、BHK-21、VERO 3种细胞,直接在荧光显微镜下用蓝光激发进行观察,在3种细胞中都可以观察到绿色荧光,而且在转染后的24、48、72 h 3个时间点上,观察到的荧光细胞数量逐渐增多,在72 h时荧光细胞的数量在3种细胞中都达到最多,总的来看,在PK-15中荧光细胞的数量最多。通过对细胞荧光的定位发现,重组质粒的荧光主要分布在胞浆内,而且细胞核周围的荧光较强,胞核与胞浆的界限明显,尤其是在PK-15细胞和VERO细胞中这种现象尤为明显。未携带E0目的DNA的pEGFP-N1 Vector转染3种细胞后,都可以观察到绿色荧光,但是整个细胞中是均匀出现荧光的。经酶切、PCR、单抗间接免疫荧光检测,PK-E0细胞中有大量的HCLV的E0表达,单纯的PK-15细胞中没有E0的表达。HCLV株在PK-E0细胞中从48h开始到72h的滴度比在PK-15细胞中的滴度要高。证明PK-E0细胞中E0蛋白的大量表达增加了HCLV在细胞中的复制。