犬瘟热病毒OP株囊膜糖蛋白H基因的克隆与表达

根据发表的犬瘟热病毒OP_CDV毒株序列设计两对引物 ,以犬瘟热病毒OP_CDV株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板 ,做RT_PCR扩增出H基因的 5′端和 3′端大小为 94 5bp、90 4bp的两个片段 ,两片段部分重叠 ,覆盖了H基因的全部编码序列。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX_6p_1载体中谷胱甘肽_S_转移酶 (GST)基因的下游 ,将重组质粒转化进宿主菌BL2 1中 ,在 37℃ 1.0mMIRTG诱导下 ,H基因分段获得了良好的表达 ,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 ,确定其表达的融合蛋白质大小分别为 5 9kDa、5 8kDa ,将表达产物回收后混合免疫小鼠。IFA显示免疫小鼠血清能与病毒感染细胞呈现特异反应 ,表明体外表达H基因保留了天然蛋白部分抗原性。

器官移植受者人巨细胞病毒糖蛋白H基因型分析

目的分析器官移植受者人巨细胞病毒(HCMV)临床分离株糖蛋白H基因型,为进一步研究其致病性、免疫性以及研制HCMV亚单位疫苗提供依据。方法以巢式聚合酶链反应(nested-PCR)检测97例器官移植受者外周血细胞中的巨细胞病毒gH基因并测序分型。结果有23例移植受者的标本经nPCR检出gH基因阳性,阳性率为23.71%,其中骨髓移植受者阳性率10.31%,肝移植受者阳性率5.15%,肾移植受者阳性率8.25%。在23例HCMV分离株中,20例得到gH基因型结果,其中gH1型10例,占50%,gH2型6例,占30%,gH1、2混合型4例,占20%,呈散在分布(χ2=4.00,P>0.05);gH基因型在各移植类型间也呈散在分布(χ2=5.652,P>0.05)。结论HCMV临床分离株糖蛋白基因分别属于gH基因型1～2型,呈散在分布。

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株 (PRV HB株 )糖蛋白 H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析 ,比较了该序列与 PRV Ka株及 NIA- 3株三者之间的同源性 .结果显示 ,克隆片段长 1396 bp,G+C含量 75 .6 % ,包括糖蛋白 H (g H ) N端 2 83个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶 (TK) C端 136个氨基酸编码区 .g H基因ORF上游调控区存在有 TATA框和 CAT框的真核启动子特征结构 .PRV HB株 g H基因片段序列与 PRV Ka株和 NIA- 3株相应序列的核苷酸同源性相同 ,为 99.6 % .推导的 g H多肽 N端第 1～ 30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸 ,具有真核信号肽的序列特征 .

第六型人疱疹病毒糖蛋白H基因的确认和在大肠杆菌中的表达

新发现的一种DNA病毒(第六型人疱疹病毒,HHV-6),是疱疹病毒家族成员。用随机法对HHV-6 DNA BamHⅠ8Kb片段进行克隆,并测定其核苷酸序列后,与其它疱疹病毒对比,发现了HHV-6编码糖蛋白H(gH)的基因,它与人细胞肥大病毒(HCMV)的gH有高达46％的相似率。找出它的读码框架后,将其大部份克隆到质粒pET3CP并分别转染大肠杆菌株BL21、PLYSS和PLYSE.^(35)S甲硫氨基酸掺入试验表明,带有部份HHV-6gH基因片段的pET3CP质粒,可在上述大肠杆菌株表达。HHV-6gH基因的确定和表达,对今后研究HHV-6和其它疱疹病毒的诊断、治疗将有重要作用.

婴幼儿人巨细胞病毒临床分离株包膜糖蛋白H基因型别研究

目的研究婴幼儿人巨细胞病毒（HCMV）临床分离株包膜糖蛋白H（gH）的基因多态性，分析该基因不同型别在HCMV感染相关的不同疾病中的分布情况及其与不同疾病之间的关系。方法收集2010年5月至2012年10月华中科技大学同济医学院附属同济医院血HCMV—IgM、IgG阳性的不同疾病住院患儿的新鲜尿标本进行病毒分离，应用巢式PCR扩增结合限制性片段长度多态性及测序对临床分离株gH基因进行分型。结果102例临床分离株经巢式PCR扩增均为阳性（43例为婴儿肝炎综合征，38例为无黄疸型肝炎，13例为肺炎，7例为血小板减少性紫癜，1例为先天性CMV感染）。102例均得到gn基因分型结果，其中gH1型62株，占60．8％；gH2型40株，占39．2％，以gH1型为主，未见混合型和发现新的型别。gH基因型别在婴儿肝炎综合征（43株分离株中26例为gH1）、无黄疸型肝炎（38株分离株中25例为gH1）及肺炎（13株分离株中9例为gH1）中与总体分布趋势一致（χ2=0．357，P〉0．05），而在血小板减少性紫癜中以gH2型别为主，7株分离株中6例为gH2（χ2=6．083，P〈0．05）。结论本地区婴幼儿临床分离株gH基因型总体以gH1型占优势，在婴儿肝炎综合征、无黄疸型肝炎、肺炎等疾病中，gH基因型别分布与总体分布差异没有统计学意义，而在血小板减少性紫癜中以gH2型为主，提示gH型别可能与不同疾病表现存在一定的相关性。

人6型疱疹病毒糖蛋白H基因测序与表达

用随机双脱氧核苷酸链末端终止法对人６型疱疹病毒糖蛋白Ｈ基因进行ＤＮＡ序列测定，找出开读框架，将其大部分插入到质粒ｐＥＴ３ＣＰ并分别转染大肠杆菌株ＢＬ２１，ＰＬＹＳＳ和ＰＬＹＳＥ。＾３５Ｓ甲硫氨基酸掺入试验表明，带有部分ＨＨＶ－６ｇＨ基因片段的ｐＥＴ３ＣＰ质粒，可在上述大肠杆菌株表达，分子量约为３７×１０＾３。

小反刍兽疫病毒H糖蛋白基因原核表达载体的构建及表达

参照GenBank中小反刍兽疫病毒(PPRV)H抗原基因序列,人工合成了PPRV H基因,将其克隆至pUC18-T质粒中,转化E.coliJM109感受态细胞,构建并选择PPRV H基因克隆重组质粒,经核苷酸序列分析正确,将其克隆至pBAD/Thio-TOPO载体中,转化E.coliTOP10感受态细胞,核苷酸序列分析证实,成功构建了PPRV H基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导,可稳定、高效地表达PPRV H抗原。SDS-PAGE分析结果表明,用终浓度为0.2 g/L的L-阿拉伯糖诱导5 h的表达量最高,表达蛋白为分子质量约83 ku的融合蛋白;经薄层扫描分析,其表达产量约占菌体总蛋白的10%。Western-blotting检测表明,诱导的蛋白能与PPRV H蛋白单抗发生特异性反应,说明表达的融合蛋白中含有PPRV H糖蛋白抗原。

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白H/L重组真核表达质粒的构建及其免疫效果评价

目的构建水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)糖蛋白H(glycoprotein H,gH)和糖蛋白L(glyco-p rotein L,gL)重组真核表达质粒,用质粒免疫小鼠,评价其免疫效果。方法以提取的VZV基因组DNA为模板,PCR扩增gH胞外区基因(g H795)和gL全长基因,与pCI-neo载体连接,构建重组真核表达质粒pCI-neo-VZV-gH795-His和p CI-neo-VZV-gL-His;将质粒单独或与CpG1826佐剂共同免疫小鼠,免疫周期为0、3、5周,采血周期为3、5、7周,检测血清抗体效价、中和效价和膜免疫荧光抗体(fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA)效价。结果重组真核表达质粒pCI-neo-VZV-g H795-His和pCI-neo-VZV-gL-His经双酶切(XbaⅠ/EcoRⅠ)和测序证明构建正确。单质粒免疫小鼠,血清抗体效价较低,双质粒免疫小鼠,血清抗体效价微弱升高,双质粒与佐剂共同免疫小鼠,血清抗体效价达1∶6000以上,CpG1826对于抗体产生具有较明显的促进作用。仅双质粒与佐剂共免疫组小鼠血清显示出中和活性,免疫后7周,血清中和效价达1∶62。双质粒与佐剂共免疫组免疫后7周小鼠血清FAMA效价为1∶8~1∶16,其余各组均为阴性。结论gH(或gHgL复合物)具有一定的免疫原性,本实验为其进一步的免疫原性研究奠定了基础。

用RT-PCR方法直接检测麻疹病毒血凝糖蛋白(H)基因

目的 应用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)法直接从临床麻疹患者的咽拭子及尿液中检出 5 70bp的特异性H基因目的条带。方法 采集临床确诊为麻疹病例的咽拭子、尿液提取RNA ,用RT -PCR方法扩增麻疹病毒血凝糖蛋白的 5 70bp核苷酸片段。结果 2 2例病人的 2 0份咽拭子样品中 ,均检测到相应条带 ,2 0份尿液中有 18份检测到相应条带 ;采用RT -PCR一次扩增的产物 ,检测灵敏度即达到 0 0 0 1TCID50 。结论 麻疹病人唾液样本的RT -PCR阳性率高于尿液 ,该方法可用于麻疹的病原学的快速辅助诊断 ,特别是对出疹初期就诊的临床符合 。

人类疱疹病毒7型糖蛋白(gL)的研究

克隆人类疱疹病毒7型(HHV-7)糖蛋白gL,分别连接入酵母双杂交载体pAS2-1、pACT2。通过双杂交技术,分析gL基因表达蛋白与gH、CD4的相互作用。发现含gL、gH基因的重组酵母菌Y190具有β-半乳糖苷酶活性,而含gL、CD4基因的重组Y190未检测到相应活性。结果表明,gL表达蛋白在酵母双杂交系统中能够与另一HHV-7糖蛋白gH结合,而与HHV-7已知受体CD4无相互作用。

丙型肝炎病毒H株包膜糖蛋白在昆早细胞中的表达

目的：利用杆状病毒表达系统，在昆虫细胞中表达了丙型肝炎病毒（HCV）H株的包膜糖蛋白E，并应用表达产物对HCV感染患者血清中抗膜蛋白抗体进行检测。方法：将HCV H株E基因片段克隆到杆状病毒转移载体上，转染昆虫细胞，表达包膜糖蛋白，经免疫杂交法鉴定表达产物，并用细胞间接免疫荧光法检测患者血清抗膜蛋白抗体的水平。结果：Western blot显示，表达产物中有多条分子量不同、可与HCV RNA阳性血清反应的蛋白。细胞免疫荧光染色表明，HCV包膜糖蛋白在细胞浆中表达。用表达产物分别检测HCV患者血清，发现仅11.4%血清中含有膜抗体。结论：成功利用昆虫细胞表达了HCV包膜糖蛋白，为HCV疫苗的研究奠定了基础。

浙江地区儿童感染人巨细胞病毒gH基因分型研究

目的了解浙江地区儿童感染人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白H(gH)基因不同型别的分布特征。方法收集2015年1月—2017年12月浙江大学医学院附属儿童医院HCMV DNA检测阳性患儿尿液样本、咽拭子样本或患儿母亲乳汁样本,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)对gH基因进行分型检测。按照年龄、样本类型、疾病类型对HCMV阳性患儿进行分组,比较各组gH基因类型分布。结果1 232例HCMV DNA阳性样本中,gH1型766例(62.2%),gH2型373例(30.3%),gH1和gH2混合型93例(7.5%)。不同年龄、样本类型及疾病类型患儿gH基因类型分布趋势一致,无统计学差异(P>0.05)。结论浙江地区儿童感染HCMV以gH1型为主,不同年龄、样本类型及疾病类型患儿HCMV gH基因类型无差异。

hCMV肝炎婴儿尿hCMVgH基因型分析

目的探讨人巨细胞病毒(h CMV)肝炎婴儿尿h CMV包膜糖蛋白H(g H)基因型分型情况。方法 2014年5月~2016年5月我科收治的80例h CMV肝炎患儿,采用荧光定量法检测尿h CMVDNA,采用直接测序法鉴定h CMVg H基因分型。结果在80例患者中,鉴定出g H1型40例(50.0%),g H2型32例(40.0%),g H1/g H2型8例(10.0%);g H1型h CMV肝炎组尿h CMV DNA水平为(2.55±0.32)×10~5copies/ml,显著高于g H1/g H2型h CMV肝炎组的(3.05±0.50)×103copies/ml,或g H2型h CMV肝炎组的(3.62±0.48)×103copies/ml(P<0.05);g H1型患儿血清ALT水平显著高于其他两型患儿(P<0.05)。结论 h CMV感染患儿以g H1型和g H2型为主,其基因型检测的意义还有待于进一步研究。

不同gH基因型别先天性人巨细胞病毒感染新生儿临床特征

目的探讨不同人巨细胞病毒(HCMV)包膜糖蛋白H(gH)基因型别先天性HCMV感染新生儿的临床特征。方法选取2018年2月—2021年2月武汉科技大学附属孝感医院确诊的110例先天性HCMV感染新生儿为研究对象,根据尿液HCMV gH分型结果分为gH1组68例和gH2组42例。收集两组患儿新生儿期临床资料包括临床表现、实验室检查、听力以及神经系统预后评估情况。结果110例先天性HCMV感染新生儿中,gH基因型分布以gH1型为主(61.82%,68/110),无混合型感染。gH1组出现血小板减少患儿的比例高于gH2组(P<0.05),两组出现宫内生长受限、脾肿大、肝肿大、瘀斑、脉络膜视网膜炎、颅内钙化和症状性感染患儿的比例均无统计学差异;gH1组血小板水平低于gH2组,总胆红素水平高于gH2组(P<0.05)。gH1组和gH2组出现听力损失患耳的比例无统计学差异,gH1组听力损失程度达中重度及以上的患耳比例高于gH2组(P<0.05)。gH1组Alarcon评分低于gH2组(P<0.05)。结论医院先天性HCMV感染新生儿中,gH1型为优势基因型;gH1基因型在新生儿期中重度以上程度听力损失患儿中比gH2型更常见,而gH2基因型HCMV感染患儿具有更高的神经系统损害风险。

12个月以下血小板减少症患儿感染巨细胞病毒的基因型特征分析与临床意义

目的收集婴幼儿巨细胞病毒(CMV)相关血小板减少症病例,研究糖蛋白B、H(gB、gH)基因型与CMV相关血小板减少症之间的关系。方法选取2017年1月—2021年12月在蚌埠医学院第一附属医院治疗的CMV阳性共697例,其中血小板减低的患儿(年龄<1岁)29例,患儿均为新发初诊患儿,无持续血小板减少>3个月。采用巢式聚合酶链反应(nPCR)和限制性长度多态性(RFLP)对gB和gH进行基因型分析。结果697例CMV感染患儿中,先天性感染76例,围产期感染378例,产后感染243例。其中,29例患儿被诊断为血小板减少症,发生率为4.16%。29例免疫功能良好的CMV感染伴血小板减少患儿,包括7例(9.2%)先天性感染,14例(3.7%)围产期感染和8例(3.3%)产后感染。诊断时血小板计数<20×10^(9)/L是围产期感染CMV相关血小板减少的常见表现。其中,在先天性和围产期感染组中肝胆症状的发生率显著升高。24例使用免疫球蛋白,9例使用抗病毒药物。本研究中最普遍的CMV基因型为gB1(60.7%)和gH2(57.1%)。结论血小板减少症是先天性CMV感染的常见表现,gB1基因型的毒力较强,gH2基因型与血小板减少症关系密切。

替罗非班联合尿激酶治疗急性ST段抬高型心肌梗死临床疗效和安全性观察

急性ST段抬高型心肌梗死是冠状动脉急性闭塞导致血流中断所引起的局部心肌缺血性坏死，其病情较重，死亡率较高，是造成心源性死亡的重要原因之一。急诊静脉溶栓治疗是急性ST段抬高型心肌梗死再灌注治疗的重要方法之一。常规溶栓治疗梗死相关动脉开通率较低，死亡率较高。血小板糖蛋白Ⅱb／Ⅲa受体拮抗剂替罗非班可有效的拮抗血小板作用，减少血栓负荷和提高溶栓成功率，降低死亡率。我们探讨替罗非班联合尿激酶溶栓治疗急性ST段抬高型心肌梗死的临床疗效及安全性。