犬瘟热病毒OP株囊膜糖蛋白H基因的克隆与表达

根据发表的犬瘟热病毒OP_CDV毒株序列设计两对引物 ,以犬瘟热病毒OP_CDV株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板 ,做RT_PCR扩增出H基因的 5′端和 3′端大小为 94 5bp、90 4bp的两个片段 ,两片段部分重叠 ,覆盖了H基因的全部编码序列。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX_6p_1载体中谷胱甘肽_S_转移酶 (GST)基因的下游 ,将重组质粒转化进宿主菌BL2 1中 ,在 37℃ 1.0mMIRTG诱导下 ,H基因分段获得了良好的表达 ,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 ,确定其表达的融合蛋白质大小分别为 5 9kDa、5 8kDa ,将表达产物回收后混合免疫小鼠。IFA显示免疫小鼠血清能与病毒感染细胞呈现特异反应 ,表明体外表达H基因保留了天然蛋白部分抗原性。

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株 (PRV HB株 )糖蛋白 H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析 ,比较了该序列与 PRV Ka株及 NIA- 3株三者之间的同源性 .结果显示 ,克隆片段长 1396 bp,G+C含量 75 .6 % ,包括糖蛋白 H (g H ) N端 2 83个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶 (TK) C端 136个氨基酸编码区 .g H基因ORF上游调控区存在有 TATA框和 CAT框的真核启动子特征结构 .PRV HB株 g H基因片段序列与 PRV Ka株和 NIA- 3株相应序列的核苷酸同源性相同 ,为 99.6 % .推导的 g H多肽 N端第 1～ 30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸 ,具有真核信号肽的序列特征 .

小反刍兽疫病毒H糖蛋白基因原核表达载体的构建及表达

参照GenBank中小反刍兽疫病毒(PPRV)H抗原基因序列,人工合成了PPRV H基因,将其克隆至pUC18-T质粒中,转化E.coliJM109感受态细胞,构建并选择PPRV H基因克隆重组质粒,经核苷酸序列分析正确,将其克隆至pBAD/Thio-TOPO载体中,转化E.coliTOP10感受态细胞,核苷酸序列分析证实,成功构建了PPRV H基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导,可稳定、高效地表达PPRV H抗原。SDS-PAGE分析结果表明,用终浓度为0.2 g/L的L-阿拉伯糖诱导5 h的表达量最高,表达蛋白为分子质量约83 ku的融合蛋白;经薄层扫描分析,其表达产量约占菌体总蛋白的10%。Western-blotting检测表明,诱导的蛋白能与PPRV H蛋白单抗发生特异性反应,说明表达的融合蛋白中含有PPRV H糖蛋白抗原。

用RT-PCR方法直接检测麻疹病毒血凝糖蛋白(H)基因

目的 应用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)法直接从临床麻疹患者的咽拭子及尿液中检出 5 70bp的特异性H基因目的条带。方法 采集临床确诊为麻疹病例的咽拭子、尿液提取RNA ,用RT -PCR方法扩增麻疹病毒血凝糖蛋白的 5 70bp核苷酸片段。结果 2 2例病人的 2 0份咽拭子样品中 ,均检测到相应条带 ,2 0份尿液中有 18份检测到相应条带 ;采用RT -PCR一次扩增的产物 ,检测灵敏度即达到 0 0 0 1TCID50 。结论 麻疹病人唾液样本的RT -PCR阳性率高于尿液 ,该方法可用于麻疹的病原学的快速辅助诊断 ,特别是对出疹初期就诊的临床符合 。