重组血小板糖蛋白Ibα活性片段在CHO细胞中表达及其功能研究

目的:建立表达重组糖蛋白Ibα活性片段(rGPIbαH1-V289)细胞株,并且纯化其表达产物,研究其生物学功能。方法:利用脂质体将含有编码GPIbαH1-V289的DNA质粒pCMV3转染CHO细胞。用亲和层析法纯化重组片段。用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产品的纯度和免疫学活性。用血小板聚集法检测纯化产品对瑞斯托霉素诱导血小板聚集功能的影响。用ELISA测定纯化产品对vWF与血小板结合能力的影响。结果:每1L培养上清液可纯化到6.15mgrGPIbαH1-V289重组产品。SDS-PAGE显示,纯化的重组片段主要在42kD处显一蛋白区带,Western blot显示,抗GPIbα单抗SZ-2能与重组片段在42kD处显单一蛋白区带。纯化重组片段能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能。ELISA测定显示纯化产品抑制血浆vWF与血小板的结合能力。结论:CHO细胞株A1能恒定表达rGPIbαH1-V289,重组片段具有较高的纯度、免疫学活性和生物学活性,有可能开发为有效的抗血栓药物。

糖蛋白Ibα基因VNTR多态性与冠心病的相关性

目的探讨皖北地区汉族人群血小板糖蛋白(GP)Ibα基因的可变数目串联重复序列(VNTR)多态性与冠心病发病的相关性。方法采用病例对照研究,以多聚酶链反应(PCR)技术,结合琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色,对皖北地区136例冠心病患者和与病例组年龄、性别相匹配的155例健康体检者(对照组)的血小板GPIbα基因VNTR多态性进行检测。结果实验仅观察到2种等位基因:B、C,3种基因型:BB、BC和CC。冠心病组VNTR多态性基因型与对照组相比差异有统计学意义(P【0.001),但与冠脉病变严重程度无明显相关性(P】0.05)。多因素Logistic回归分析显示,VNTR CC基因型为冠心病发病的一个独立危险因素(OR=2.744,95%CI:1.122~6.707),而BC基因型为冠心病发病的遗传保护因素(OR=0.299,95%CI:0.127~0.700)。结论皖北地区汉族人群中血小板GPIbα基因VNTR多态性与冠心病的发病明显相关,但VNTR基因型分布与冠脉病变严重程度并无明显相关性。

维持性血液透析患者血小板膜糖蛋白Ibα和相关标志物的表达及意义

目的研究维持性血液透析(MHD)患者外周血血小板膜糖蛋白Ibα(GPIbα)、α颗粒膜糖蛋白(CD62P)和溶酶体膜蛋白(CD63)的表达及检测血小板最大聚集率,分析其与健康对照组的差异。方法选取2015年8月至2016年12月期间在中山大学附属第八医院接受MHD的慢性肾衰竭患者49例和体检中心健康人群33例作为研究对象,采用流式细胞术检测MHD患者组和健康对照组外周血血小板膜糖蛋白GPIbα、CD62P和CD63的表达。采用电阻法检测血小板最大聚集率。结果相较于健康对照组,MHD患者组血小板膜糖蛋白GPIbα表达量降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。CD62P表达升高,差异无统计学意义(P=0.08)。CD63的表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。血小板最大聚集率下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。MHD患者与健康对照组之间的血小板膜糖蛋白GPIbα、CD63表达和血小板最大聚集率的差异明显。结论MHD患者血小板GPIbα表达下降,血小板最大聚集率降低,血小板聚集功能紊乱激活血小板,而血小板CD63表达升高,血小板进一步活化导致患者高凝状态加剧,可能增加血液透析患者动静脉内瘘血栓形成等事件的发生率。

中国人血小板膜糖蛋白Ibα基因VNTR多态性与急性冠脉综合征的关系

目的:探讨血小板GP Ibα基因VNTR多态性与急性冠脉综合征(ACS)的关系。方法:入选135例经冠状动脉造影及临床诊断为ACS患者,PCR扩增目的DNA,采用SDS-PAGE进行VNTR多态性检测,与对照组比较有无差异。135例中39例住院期间发生心脏缺血事件,比较有事件组和无事件组VNTR多态性。结果:①VNTR多态性存在5种基因型:AB、AC、BB、BC和CC,未发现含D等位基因的个体;②基因型肺(AB+AC)和BC在ACS组中较对照组多见,但两组间无显著性差异。A等位基因频率在ACS组有较高趋势(OR:1.56),但与对照组无统计学差异。多因素Logistic回归分析发现5种基因型和3种等位基因的OR值无显著性意义;③发生院内缺血事件组AB基因型较无事件组偏多,但两组间无显著性差异。多因素逐步logistic回归分析发现各基因型不是影响缺血事件的独立变量。根据OR值可以发现重复序列数越多的等位基因,其频率在有事件组就越高的趋势(OR_C:0.72;OR_B:1.33;OR_A:1.50)但两组间无统计学差异。结论:血小板GPIbα巨糖肽区域的VNTR基因多态性与ACS间无显著相关性,对中国人ACS患者住院期间联合终点的发生无显著影响。

川崎病患儿血小板膜糖蛋白Ibα基因多态性分析

目的研究血小板膜糖蛋白Ibα（GPIbot）基因HPA-2a／b多态性与KD发病及并发冠状动脉损伤（CAL）之间的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性内切酶片断长度多态性分析技术结合琼脂糖凝胶电泳技术，检测30例KD患儿和60例健康对照组儿童GPIbα基因HPA-2a／b多态性位点的基因型和等位基因分布。结果本组KD病例和健康对照组儿童GPIbα基因HPA-2a／b的基因型均只有TC型和CC型，而未发现TT型。KD组GPIbα基因HPA-2a／b多态性的CC、TC、TT基因型分布频率和C、T等位基因频率与健康对照组比较差异均无统计学意义（χ2=0．052、0．048，P均〉0．05），KD组中合并CAL组与无CAL组基因型分布频率和等位基因频率比较差异亦无统计学意义（χ2=2．672、2．481，P均〉0．05）。结论GPIba基因的HPA-2a／b多态性与KD及其CAL的发生均无明显相关性。

力调控糖蛋白Ibα与细丝蛋白相互作用的分子动力学模拟

静息血小板中细丝蛋白a的17号结构域(FLNa17)可组成型结合到血小板膜糖蛋白Ibα(GPIbα)的胞质尾部(GPIbα-CT),抑制下游信号活化,而配体的结合和血流剪切力可激活血小板。为模拟来自GPIbα胞外配体向胞内传递的正向拉力及血小板细胞骨架形变传递的侧向张力,本文在GPIbα-CT/FLNa17复合物上施加两种受力模式,采用分子动力学模拟方法探究机械力对该复合物亲和力及力学稳定性的调控。本研究首先识别出GPIbα-CT与FLNa17接触面上的9对关键氢键是维持复合物结构稳定的基础。其次,发现仅正向拉力作用下,这些氢键作用网络才会发生断裂,并导致复合物的最终解离;而侧向张力下,FLNa17两端的二级结构会解折叠以保护复合物接触面不受机械力破坏。在0~40 pN范围内,正向拉力的增加促使GPIbα-CT氨基酸序列中第563位的苯丙氨酸的氮原子(PHE563-N)的外旋和复合物解离概率的提高。本研究首次在原子层面揭示胞外配体传递的正向拉力可更有效解除FLNa17对GPIbα下游信号的抑制,为深入理解力调控的血小板胞内信号通路提供参考。

血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)在我国蒙古族人群中分布的多态性

血小板膜糖蛋白Ｉｂ（ＧＰＩｂ）在凝血过程中起重要作用。已有报道ＧＰＩｂ在人群中呈多态性分布，表现为分子量稍有差异。本文旨在研究ＧＰＩｂ在我国蒙古族人群中分布的多态性，以期探索不同民族之间是否存在差异。血小板分离自１０２名蒙古族健康青少年。血小板膜蛋白经ＳＤＳ┐聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ┐ＰＡＧＥ）后，再转移至硝酸纤维素膜上（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｉｎｇ），用生物素化的麦胚凝集素（ＷＧＡ／Ｂｉｏ）偶联生物素卵白素结合的辣根过氧化酶（ＡＢＣＫｉｔ）染色，以４┐氯┐１┐萘酚显色，结果显示出硝酸纤维素膜上的ＧＰＩｂα链，分子量分别为１４１，１３６，１３２，１２８ＫＤ，即Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ四型，其出现频率分别为０．０７８，０．４６１，０．３９２及０．０６９。这一结果与我国汉族人群中ＧＰＩｂ分布的多态性极为相似，均出现有四型。各型出现的基因频率在两个民族之间无显著性差异；其所构成的表型在两个民族之间似有不同。

体外循环期间心腔血血小板膜糖蛋白Ib含量的变化

目的 探讨心肺转流 (CPB)体外循环期间心腔血血小板膜糖蛋白Ib的变化及与凝血的关系。方法 用流式细胞术对 40例先天性心脏病房或室间隔缺损患者在CPB下行心内修补术时的心腔血血小板膜糖蛋白Ib免疫荧光定量测定 ,同时与本组体外循环全血比较。结果 全血血小板膜糖蛋白Ib在选定的三个时点分别下降 10 %、2 8%和 2 5 % ,而心腔血则都下降 5 0 %以上。结论CPB期间心腔血血小板表面膜糖蛋白Ib明显减少 ,已无凝血功能。

中国鄂温克族和达斡尔族人群中血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)的多态性

研究旨在进一步探索同一人种的不同民族之间 GPIb的多态性是否存在差异。血小板从 84名健康鄂温克族、85名达斡尔族青年志愿者采血分离而获得。血小板样品经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS- PAGE)后 ,再转移至硝酸纤维素膜上(Western blotting) ,用生物素化的麦胚凝集素 (WGA/ Bio)偶联辣根过氧化酶复合物试剂盒 (ABC kit)分步孵育 ,再以 4-氯 - 1-萘酚显影。膜上呈现的深灰色带即是 GPIbα链 ,其分子量分别为 141、 136、 132、 12 8k D,此即 A、B、C、D四型 ,此为基因型 ,其中每两型构成一个表型。本研究证明 ,在我国鄂温克族人群中 ,等位基因 A、B、C、D的频率分别为 0 .113、0 .375、0 381、 0 .131;在达斡尔族中 ,A型为 0 .12 4、B型为 0 .40 6、C型为 0 .35 9、D型为 0 .112。经统计学分析 ,在这两个民族的人群之间 ,其 GPIb各基因频率无显著性差异。两个民族人群的 GPIb表型经卡方检验也无显著性差异。由此结果说明 ,鄂温克、达斡尔两个民族的人群之间 。

蛇毒血小板膜糖蛋白Ib结合蛋白研究进展

血栓形成在动脉粥样硬化、急性心肌梗死及PTCA术后再狭窄等病理过程中起着重要作用.通过对血小板栓塞形成的机制研究表明:血浆中血管假性血友病因子(vWF)与血小板GPIb的相互作用在止血过程和血栓形成的早期阶段起着关键作用.vWF主要来源内皮和巨核细胞,作为分子桥介导血小板和内皮下胶原的粘附反应,与GIb结合位点位于vWF分子509～695残基之间A1重复区的二硫环上.

抗血小板膜糖蛋白Ib单克隆抗体的制备、鉴定及其功能的初步研究

目的:制备抗人血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)单克隆抗体(mAb),并进行生化鉴定与初步探讨其临床应用。方法:采用血小板免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA法筛选和克隆化培养,获得1株抗人GPIbmAb的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得mAb;免疫双扩散鉴定其抗体亚类;流式细胞术和免疫放射法鉴定其识别的抗原;ELISA法检测该抗体对血浆血管性血友病因子(vWF)的瑞斯托霉素辅因子活性的影响。结果:成功制备了1株抗人GPIbmAb,命名为SZ-151。ELISA法测定其腹水效价为1∶20 000,免疫双扩散鉴定其为IgG1亚类。免疫放射法和流式细胞术检测结果证实SZ-151和mAb SZ-2识别同一抗原GPIb,且作用位点不同。ELISA结果显示,SZ-151对瑞斯托霉素辅因子活性无抑制作用。结论:获得1株新的抗血小板膜糖蛋白Ib的mAb,可用于血浆vWF的瑞斯托霉素辅因子活性检测,为血管性血友病的诊断和分型提供了有效的工具。

抗血小板膜糖蛋白Ib凝血酶受体单抗的制备及功能研究

目的 制备抗人血小板膜糖蛋白Ｉｂ(ＧＰＩｂ)单克隆抗体(单抗)并研究其功能。方法杂交瘤技术制备单抗,ＥＬＩＳＡ法筛选与 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定单抗识别的抗原,比浊法检测该单抗对血小板聚集的抑制作用。结果(ｌ)获得一株新的抗人血小板膜糖蛋白单抗ＳＺ１６。(２)在非还原状态下,ＳＺ１６识别分子量１６５０００的抗原,表明ＳＺ１６抗原为ＧＰＩｂ。(３)该单抗为ＩｇＧ１亚类。(４)ＦＣＭ检测表明,ＳＺ１６与正常人及血小板无力症(ＧＴ)患者血小板结合率很高;用凝血酶处理血小板后,几乎完全阻断ＳＺ１６与血小板的结合。(５)该单抗抑制低浓度凝血酶引起的血小板聚集,对ＡＤＰ、瑞斯托霉素和花生四烯酸引起的血小板聚集无抑制作用。结论ＳＺ１６为一株新的抗ＧＰＩｂ凝血酶受体的单抗。

血小板膜糖蛋白1bα基因Kozak序列-5T/C多态性与冠心病的关系

目的探讨血小板膜糖蛋白Ibα(GPIbα)基因Kozak-5T/C多态性与冠心病及其病变程度的关系。方法应用聚合酶链反应—限制型片段长度多态性技术(PCR-RELP)检测196例浙江地区汉族人(冠心病组105例,对照组91例)Kozak-5T/C基因型及等位基因频率。结果GPIbα基因Kozak-5T/C多态性在冠心病组及对照组,单支病变组与多支病变组之间的分布差异没有显著性。结论GPIbα基因Kozak-5T/C多态性与冠心病的关系仍需进一步探讨。

髓过氧化物酶、膜糖蛋白Ib及抗氨甲酰化蛋白在老年风湿性多肌痛中的表达与意义

目的分析髓过氧化物酶(MPO)、膜糖蛋白Ib(GPIb)及抗氨甲酰化蛋白(CarP)在老年风湿性多肌痛(PMR)中的表达与意义。方法选择2020年1月~2021年1月在浙江省温州市人民医院收治的PMR患者80例,依据年龄分组,其中老年PMR组(年龄≥60岁)40例,非老年PMR组(年龄<60岁)40例,两组均给予泼尼松治疗,另选择同期老年健康体检者40例作为对照组。测定两组血清中GPIb、MPO、CarP表达水平,并进行PMR-AS评分,分析GPIb、MPO、CarP水平与PMR-AS评分的相关性。结果治疗前,老年PMR组MPO、CarP及PMR-AS评分均高于其他两组,GPIb低于其他两组,差异具有极显著性意义(P<0.01);治疗后,老年PMR组与非老年PMR组GPIb均升高,MPO、CarP均降低,两组差异无统计学意义(P>0.05);GPIb与PMR-AS评分呈负相关(r=-0.668,P<0.01),MPO、CarP与PMR-AS评分呈正相关(r=0.651、r=0.689;P<0.01)。结论MPO、CarP在老年PMR中的表达升高,GPIb降低;激素治疗对不同年龄组的PMR患者疗效相当。

血小板膜糖蛋白I bα基因多态性与脑梗死关系的研究

目的:探讨血小板膜糖蛋白I bα基因HPA2多态性与脑梗死之间的关系。方法:选取按年龄、性别、有无高血压及糖尿病病史相匹配的病例组及对照组各100例,PCR扩增GPI bα基因长为588bp的片段,产物经限制性内切酶Hinl I消化后确定其基因型。结果:在总病例组、大动脉粥样硬化型脑梗死组及小动脉闭塞型脑梗死组(TOAST分型)与相应对照组之间GP I bαHPA2基因型频率的分布差异无显著性;大动脉粥样硬化型中杂合突变型比例(16.1%) 要高于小动脉闭塞型中杂合突变型比例(10.1%),但差异无显著意义。结论:GP I bαHPA2基因杂合突变型可能并非脑梗死的危险因素。

100例脑梗死患者血小板糖蛋白Ⅰbα基因多态性测定及临床意义的研究

目的探讨血小板糖蛋白Ⅰbα基因HPA2多态性在脑梗死发病中的作用。方法以分子生物学技术采用PCR方法测定100脑梗死患者与正常对组血小板糖蛋白Ⅰbα基因HPA2多态性。结果100例脑梗死患者组、大动脉粥样硬化型脑梗死患者组及小动脉闭塞型脑梗死患者组(TOAST分型)与相应对照组之间GPⅠbαHPA2基因型频率的分布差异无显著性;大动脉粥样硬化型中杂合突变型比例(16.1%)要高于小动脉闭死型中杂合突变型比例(10.1%),但差异无显著意义。结论GPⅠbαHPA2基因杂合突变型可能并非是脑梗死的危险因素。

中国眼镜蛇毒蛋白酶natrahagin水解血小板膜糖蛋白Ⅰb和抑制血小板聚集的作用

目的 :观察从中国眼镜蛇 (Najanajaatra)毒中纯化的蛋白酶natrahagin水解血小板膜糖蛋白Ⅰb(plateletmembraneglycoproteinⅠb ,GPⅠb)和抑制血小板聚集的作用。方法 :通过SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS_PAGE)检测以及凝胶图像光密度分析系统分析natrahagin对血小板膜糖蛋白的水解作用。比浊法测定血小板聚集率。结果 :Natrahagin选择性地水解GPⅠb ,切除分子量约 3.3× 10 4 的片段。Natrahagin(0 0 2 5～ 0 .1mg kg)静脉注射可显著抑制低浓度凝血酶 (10 0U L)诱导的兔洗涤血小板聚集 ,效应呈剂量依赖性。结论 :Natrahagin具有水解GPⅠb和抑制后者介导的血小板聚集的作用。

龙柴降血方对原发性血小板增多症患者凝血功能及血小板活化蛋白的影响

目的观察龙柴降血方对原发性血小板增多症(ET)患者凝血功能及血小板活化蛋白的影响。方法选取2020年1月—2021年10月中国中医科学院西苑医院收治的ET患者22例,给予龙柴降血方治疗4个月,观察治疗前后血栓弹力图指标[凝血时间(R)、凝血速率(K)、纤维蛋白功能(Angle)、血栓最大振幅(MA)、血栓最大振幅时间(TMA)、即时振幅(A)、30 min振幅(A30)、从血样开始检测到曲线分叉所需时间(SP)、血凝块溶解时间(CLT)]、高凝状态发生率和积分变化。选取其中15例ET患者,采用平行反应监测(PRM)技术检测患者治疗前后血小板活化蛋白[血小板膜糖蛋白Ibα(GPIbα)、糖蛋白VI(GPVI)、选择素-P(SELP)]表达水平,分析比较血小板聚集改善患者和血小板聚集增强患者上述各蛋白表达水平的差异;取5例健康者和10例ET患者治疗前后血清,采用Western blot法检测血清GPIbα表达情况;分析15例ET患者MA与血清GPIbα表达水平的相关性。结果与治疗前比较,龙柴降血方治疗后MA、CLT、高凝状态发生率、高凝状态积分和血清GPIbα、GPVI表达水平均明显降低(P均<0.05),血清SELP表达水平无明显变化(P>0.05)。治疗后血小板聚集改善患者血清GPIbα表达水平明显低于血小板聚集增强患者(P<0.05),GPVI表达水平无明显变化(P>0.05)。与健康人相比,10例ET患者治疗前血清GPIbα相对表达量明显增高(P<0.05);10例ET患者治疗后血清GPIbα相对表达量较治疗前明显降低(P<0.05)。龙柴降血方治疗后MA下降与GPIbα表达下调呈正相关(r=0.6986,P<0.05)。结论龙柴降血方能够抑制ET患者血小板聚集,改善高凝状态,其机制可能与抑制GPIbα蛋白介导的血小板活化信号通路有关。