类糜蛋白酶抑制剂对人结肠肥大细胞组胺释放的影响

目的 研究类糜蛋白酶抑制剂对人结肠肥大细胞释放组胺的影响。方法 用酶消化人结肠组织并分离细胞成份。激发过程在LP4试管中、37℃条件下完成。组胺水平用以玻璃纤维为基础的荧光方法测定。结果 类糜蛋白酶抑制剂ZIGPFM、TPCK和α1 抗胰蛋白酶无明显刺激人类结肠肥大细胞释放组胺的作用。 3种类糜蛋白酶抑制剂均可以剂量依赖性方式抑制抗IgE抗体诱导的组胺释放 ,最大浓度的ZIGPFM(1mmol·L-1)、TPCK(80mmol·L-1)和α1 抗胰蛋白酶(30mmol·L-1)可分别抑制 37%、2 6 %和 36 8%的组胺释放。在 37℃条件下同结肠细胞预培养 2 0min与无预培养相比 ,ZIGPFM和TPCK抑制抗IgE抗体诱导的组胺释放的作用略有增强。 3种类糜蛋白酶抑制剂均可以剂量依赖性方式抑制CI诱导的组胺释放 ,最大抑制范围在 2 3 6 %～ 35 %之间。在 37℃条件下同结肠细胞预培养 2 0min与无预培养相比 ,TPCK对CI诱导的组胺释放的抑制作用略有增强 ,但ZIGPFM则无此特点。结论 我们发现了类糜蛋白酶抑制剂可抑制人结肠肥大细胞IgE依赖性和非依赖性组胺释放 ,提示类糜蛋白酶抑制剂可能有抗炎症性肠病的作用 。

类糜蛋白酶抑制剂对人大肠肥大细胞类胰蛋白酶释放的影响

目的:研究类糜蛋白酶抑制剂对人大肠肥大细胞释放类胰蛋白酶的影响。方法:人大肠组织经酶消化后,细胞成份有全HBSS重新悬浮。激发过程在LP4试管中、37℃条件下完成。类胰蛋白酶水平用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定。结果:促分泌剂抗IgE抗体和CI在培养15分钟和35分钟时可明显刺激人大肠肥大细胞类胰蛋白酶的释放,在相同实验体系中,类糜蛋白酶抑制剂ZIGPFM、TPCK和α1抗胰蛋白酶无明显刺激人大肠肥大细胞释放类胰蛋白酶的作用。类糜蛋白酶抑制剂均可以剂量依赖性的方式抑制抗IgE抗体诱导的类胰蛋白酶的释放,最大浓度的ZIGPFM(1μmolml)、TPCK(80μmolml)和α1抗胰蛋白酶(30μmolml)可分别抑制37%、40%和36.6%的类胰蛋白酶释放。在37℃条件下同大肠细胞预培养20分钟与无预培养相比,ZIGPFM和TPCK对抗IgE抗体诱导的类胰蛋白酶释放的抑制作用略增强。Amastatin对抗IgE抗体诱导的类胰蛋白酶的释放无作用。类糜蛋白酶抑制剂均可以剂量依赖性的方式抑制CI诱导的类胰蛋白酶的释放,抑制范围在23%～35.3%。在37℃条件下同大肠细胞预培养20分钟与无预培养相比,ZIGPFM对CI诱导的类胰蛋白酶释放的抑制作用有增强,TPCK则无此特点。结论:类糜蛋白酶抑制剂可抑制人大肠肥大细胞IgE依赖性和非依赖性类胰蛋白酶的释放,提示类糜蛋白酶抑制剂可望成为炎症性肠病或其它肥大细胞相关疾病的一个新的治疗途径。

糜蛋白酶抑制剂对糖尿病仓鼠肾功能保护作用的实验研究

目的:观察糜蛋白酶抑制剂对糖尿病仓鼠肾脏的保护作用,进而探讨其保护肾脏损伤的机制。方法:(1)通过链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射法制备仓鼠糖尿病模型。实验分为5组,每组8只。(2)通过Western blot检测各组动物糜蛋白酶抗体、血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin I-converting enzyme,ACE)、过氧化物酶4(NADPH oxidase-4,NOX-4)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶亚单位p22phox的表达情况。(3)通过免疫荧光检测各组动物糜蛋白抑制剂对血管紧张素系统(reninangiotensin system,RAS)的成分,氧化应激的影响。(4)通过q RT-PCR及Western blot检测糜蛋白抑制剂对人血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,ANG-Ⅱ)来源的基质蛋白合成影响。结果:(1)免疫组化结果显示糖尿病组仓鼠肾小管和血管球糜蛋白酶表达明显。qRT-PCR结果显示糜蛋白酶m RNA水平较对照组普遍增高(P<0.01)。而胰岛素治疗后降至正常水平。(2)糜蛋白酶抑制剂抑制了糖尿病仓鼠肾内ANG-Ⅱ升高,同时明显降低了8-羟化脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHd G)分泌水平。(3)NOX-4和p22phox染色表明糖尿病组血管球和肾小管区域氧化产物明显增高,而糜蛋白酶抑制剂抑制氧化产物的升高(P<0.01)。(4)Western blot证实了糖尿病组血管球NOX-4和p22phox蛋白的水平较对照组高,糜蛋白酶抑制剂明显降低了其表达。(5)血管球转化生长因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)表达糖尿病组高于对照组,同样糜蛋白酶抑制剂治疗后大大降低了TGF-β1水平。结论:糜蛋白酶抑制剂能保护糖尿病仓鼠的肾功能,其机制是通过降低肾内ANG-Ⅱ水平和氧化应激水平来保护糖尿病肾脏损伤。

糜蛋白酶抑制剂保护糖尿病仓鼠肾功能的机制研究

目的观察糜蛋白酶抑制剂对糖尿病仓鼠肾脏的保护作用,进而探讨其保护肾脏损伤的机理。方法链脲佐菌素腹腔注射法制备仓鼠糖尿病模型。通过分子生物学技术、免疫组织化学技术、免疫印记技术检测各组动物糜蛋白酶,RAS成分:ACE、肾素、ANG-I、ANG-II;氧化应激水平:8-Ohd G,NOX-4,p22phox,以及TGF-β1的表达情况。结果糜蛋白酶抑制剂抑制了糖尿病仓鼠肾内ANG-II升高,同时明显降低了8-OHd G分泌水平。NOX-4和p22phox染色表明糖尿病组血管球和肾小管区域氧化产物显著增高,而糜蛋白酶抑制剂抑制氧化产物的升高(P<0.01)。Western blot证实了糖尿病组血管球NOX-4和p22phox蛋白的水平较对照组高,糜蛋白酶抑制剂显著降低了其表达。血管球TGF-β1表达糖尿病组高于对照组,同样糜蛋白酶抑制剂治疗后大大降低了TGF-β1水平。结论糜蛋白酶抑制剂能保护糖尿病仓鼠的肾功能,其机制是通过降低肾内ANG-II水平和氧化应激水平来保护糖尿病肾脏损伤。

抑制肾素-血管紧张肽系统药物研究

肾素-血管紧张肽系统(RAS)是药物治疗心血管系统疾病的关键作用靶点。目前的主要药物是血管紧张肽转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张肽Ⅰ受体拮抗剂(ARBs),因此被认为是作用于RAS治疗心血管疾病的经典药物,但是还有许多能够通过其他途径而产生对RAS的抑制作用。本文综述了目前发现的一些其他途径以及和经典途径的联系以及阻断它们产生的可能效应,包括ACEI抑制剂、ARBs、肾素抑制剂、糜蛋白酶抑制剂、血管紧张肽转化酶2、中性肽链内切酶抑制剂、醛固酮抑制剂以及针对RAS的基因治疗和免疫治疗。

重组眼镜王蛇属胰蛋白酶和糜蛋白酶双重抑制剂对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的探究重组眼镜王蛇属胰蛋白酶和糜蛋白酶双重抑制剂(OH-TCI)在大肠杆菌中的表达与纯化及其对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的保护作用。方法将Pet32a-OH-TCI重组质粒转化到大肠杆菌中,通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,经烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus,TEV)酶切和镍亲和层析后获得具有天然活性的OH-TCI。健康SD大鼠,随机分为对照组和OH-TCI药物组。药物组于术前5 min腹腔注射OH-TCI,对照组给予等体积生理盐水处理。结扎大鼠的左冠状动脉前降支30 min后,复灌120 min构建大鼠MIRI模型。检测大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)活性和丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6的含量等指标,评估具有天然活性的重组蛋白酶抑制肽OH-TCI对大鼠MIRI的保护作用。结果重组蛋白酶抑制肽OH-TCI在pET32a/Rosetta-gami(DE3)表达系统中以融合蛋白形式得到可溶性表达,通过TEV酶切、两次亲和层析纯化后,得到具有天然活性的重组OH-TCI。与对照组相比,OH-TCI可使心肌MIRI大鼠血清中LDH活性、MDA含量和IL-6的释放量显著下降(P<0.01);炎性因子TNF-α释放量明显降低(P<0.05)。结论具有天然活性的重组蛋白酶抑制肽OH-TCI能够在大肠杆菌成功表达,并对心肌缺血再灌注样损伤具有一定的保护作用。