杆状病毒表达系统表达BCoV纤突蛋白及其对小鼠的免疫原性

旨在为表达牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的纤突蛋白(S蛋白),并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SWUN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板,针对昆虫细胞进行密码子优化和合成,构建重组质粒pFastBac-Dual-S,与DH10Bac同源重组后转染昆虫细胞收获重组杆状病毒rpFastBac-S,利用基因组PCR、免疫印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验对其进行鉴定,测定杆状病毒滴度。优化和筛选感染剂量对蛋白表达的影响,超速离心纯化蛋白,免疫小鼠和评估其免疫效果。结果显示:优化后全长4108 bp的BCoV S基因CAI(密码子适应指数)从0.39调整为0.87,平均GC含量从35.8%调整为50.6%。经双酶切、PCR验证,重组质粒与重组杆粒均构建成功。用5μg重组杆粒Bacmid-S转染Sf9细胞并传代至第四代后细胞病变趋于稳定,感染杆状病毒约20 h后产生典型病变,收获重组杆状病毒进行鉴定。PCR电泳结果显示重组杆粒携带S目的蛋白基因;间接免疫荧光试验显示,试验组观察到特异性绿色荧光;Western blot结果显示重组杆状病毒rpFastBac-S所表达的蛋白为S目的蛋白,目的条带位于250 ku左右,感染剂量MOI=0.5时蛋白表达量最高。将50μg蛋白、20μg CpG免疫增强剂与等体积MF59佐剂充分混合乳化后,肌肉注射免疫小鼠,间接ELISA试验结果显示,小鼠免疫蛋白后产生了IgG特异性抗体,且抗体水平高于佐剂对照组(P<0.001),最高抗体效价达1∶12800;微量中和试验结果显示,小鼠血清中和效价最高达1∶224,试验组中和效价平均值高于灭活病毒组,但统计学差异不显著(P>0.05)。本研究利用杆状病毒表达系统表达了牛冠状病毒S蛋白,并对S蛋白免疫保护效果做了进一步评价,为后续牛冠状病毒疫苗研究提供了理论依据。

P2X_7受体在神经系统表达及功能的研究进展

P2X受体是对ATP及其类似物敏感的配体门控离子通道。迄今已从哺乳动物成功克隆出7种P2X亚单位（P2X1-7）。P2X7受体（P2X7 receptor，P2XTR，曾被称为P2Z）因其独特的结构和功能特点而倍受关注。P2X7R广泛分布于免疫细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、骨组织等多种细胞和组织。在神经系统，P2X7R参与神经递质释放、胶质细胞活化，对病理状态下多个信号通路具有关键的调节作用。

家蚕丝素重链表达系统表达外源蛋白的应用研究进展

家蚕丝腺拥有出色的丝蛋白合成能力,家蚕又具有容易饲养、生长周期短等优点,利用家蚕丝腺来生产大量有价值的蛋白,生产出的重组蛋白可在生物、医药、材料学等领域广泛应用,所以家蚕丝腺是一种理想的生物反应器。高效表达系统的构建是家蚕丝腺生物反应器产生重组蛋白的关键步骤之一。为了构建出更加优良的表达系统,结合国内外研究进展,对家蚕丝素重链表达系统的建立、发展与应用情况进行综述,为该系统的深入研究与应用提供参考。

应用pQE30系统表达和纯化乙型肝炎病毒核心抗原

目的建立高效、快速、简便的表达和纯化ＨＢｃＡｇ系统，为进一步研究ＨＢｃＡｇ在乙型肝炎发病机理中 的作用及 ＨＢＶ Ｃ基因变异产生 ＨＢｃＡｇ特征。方法应用 ｐＱＥ３０系统在原核细胞表达和纯化 ＨＢｃＡｇ。结果目的蛋 白表达量占细菌总蛋白的２６．２％；５００ｍｌ诱导表达的菌液可得平均５ｍｇ的ＨＢｃＡｇ；纯化的ＨＢｃＡｇ纯度可达到９１.０％； 免疫印迹分析，表达的ＨＢｃＡｇ具有多克隆抗－ＨＢｃ结合活性。结论建立了一套高效、快速表达和纯化ＨＢｃ Ａｇ系统。

昆虫杆状病毒系统表达外源蛋白的糖基化

昆虫表达系统作为一类应用广泛的真核表达系统 ,具有与多数高等真核生物相类似的翻译后修饰的过程。但其生产的重组糖蛋白一般仅具有高甘露糖或寡甘露糖型糖链 ,难以生成复杂构型糖链成为该系统的缺陷之一。综述了目前昆虫杆状病毒系统表达外源蛋白的糖基化研究进展。

鹅副粘病毒HN基因在昆虫杆状系统表达及其抗原性鉴定

血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)是鹅副粘病毒诱导体液免疫的重要靶抗原。经pMD18-T-HN阳性质粒扩增了HN基因,亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A,并将其与线性化的杆状病毒共转染对数生长期的sf 9细胞,得到重组杆状病毒rBv-HN,试验表明,HN在昆虫细胞中得到表达,且产物具有抗原性。

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素的方法研究

目的探索用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素(endostatin)重组蛋白的最佳生产工艺路线。方法用pTh ioH is-endo重组质粒转化不同的大肠杆菌BL21、JM109、DH5α,经几种不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(isopro-pylth io-galactoside,IPTG)诱导表达重组融合蛋白,或诱导表达不同时间后,采用SDS-PAGE分析表达产物;按所优化的条件进行重组内皮抑素的表达、包涵体的提取、洗涤、变性和复性,最后经N i+柱纯化,再通过SDS-PAGE分析纯化的结果。结果3种大肠杆菌表达效果相差无几,最佳IPTG的浓度0.9 mmol/L,最佳诱导时间为5 h,经N i+柱纯化后可获得可溶性的重组内皮抑素。结论利用本实验的优化条件可获得高产量、高纯度、可溶性的小鼠内皮抑素重组蛋白。

利用Bac-to-Bac系统表达棉蚜的乙酰胆碱酯酶

Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统是一种高效真核表达系统。采用重组DNA技术构建棉蚜乙酰胆碱酯酶1（AChE1）表达质粒，应用该系统在昆虫Sf9细胞系中成功表达了棉蚜的AChE1。表达的AChE以可溶性形式释放于细胞培养液中，对其自然底物类似物ATCh1的Km值为（144．5±28．6）μm；对抗蚜威、唑蚜威、氧化乐果和灭赐松等4种杀虫剂的敏感性指数（Ki值）分别为513、l883、5和23（mM·min）^-1，与文献报道的测定结果基本一致。昆虫细胞被重组病毒感染后第2-3天所得产物的活性最高；该产物在-20℃保存90d后活性没有明显下降，4℃保存60d后下降40％，室温（22℃）保存7d后即下降70％。

Tet-on慢病毒系统表达弓形虫ROP18的研究

目的用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)的293T细胞株。方法PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体p LVCT-t TR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体p LVCT-t TRKRAB-ROP18。经鉴定后将该重组载体(6μg)与辅助质粒ps PAX2(4μg)和p MD2.G(2μg)共同转染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞荧光。于转染后48和72 h收集含有慢病毒颗粒上清液,感染293T细胞。以1μg/ml强力霉素(DOX)诱导293T细胞表达ROP18,荧光显微镜下观察细胞荧光,RT-PCR法检测293T细胞中的ROP18表达情况。结果 PCR扩增rop18片段为960 bp,与预期大小一致。经PCR和酶切鉴定重组慢病素载体构建成功。转染48 h后,293T细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光。经DOX诱导24 h即可观察到293T细胞中明亮绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,293T细胞ROP18可产生960 bp特异条带,与预期结果一致。结论采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定表达弓形虫ROP18的293T细胞株。

昆虫杆状病毒系统表达登革2型病毒prM/E蛋白

目的:构建表达登革2型病毒prM/E蛋白的真核细胞系。方法:应用聚合酶链反应(PCR)方法从含有登革2型病毒prM/E基因的质粒中扩增得到prM/E基因。将该片段亚克隆到pGEM-T Easy载体上,用XhoⅠ和NheⅠ双酶切将其与同样双酶切的pFastBac Dual质粒连接,构建转移载体pFBD-prM/E。将转移载体转化的同时,含有杆状病毒穿梭载体Bacmid和Helper质粒的感受态DH10 Bac得到重组Bacmid;用后者转染Sf 9细胞获得重组杆状病毒。双酶切鉴定构建的重组杆状病毒转移载体pFBD-prM/E,间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达。结果:通过间接免疫荧光法可观察到特异性绿色荧光,即检测到prM/E蛋白的表达。结论:利用昆虫杆状病毒系统成功表达了登革2型病毒prM/E蛋白,为登革病毒prM和E蛋白的功能研究、登革病毒感染的诊断以及登革病毒样颗粒疫苗的研制奠定了基础。

昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白及其生物学功能的初步鉴定

目的建立昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白技术平台并鉴定其表达产物的生物学功能。方法用搭桥PCR获得γ9Fc和δ2(OT3)Fc基因片段,构建成pBACp10ph-γ9/δ2(OT3)-Fc重组质粒,与AcNPV昆虫病毒DNA共转染昆虫sf9细胞,表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白;Western blot鉴定TCRγ9/δ2-Fc蛋白表达位置;胞内流式细胞仪检测γ9Fc和δ2(OT3)Fc两基因表达效率;蛋白G亲和层析后,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度;激光共聚焦扫描显微镜技术和生物传感器技术检测了TCRγ9/δ2-Fc蛋白与SKOV3细胞和MNS蛋白的结合特性。结果成功构建pBACp10ph-γ9/δ2(OT3)-Fc表达载体,经鉴定发现TCRγ9/δ2-Fc蛋白在sf9细胞内表达,但γ9Fc和δ2(OT3)Fc两基因的表达效率有较大差异。纯化得到一定纯度的TCRγ9/δ2-Fc蛋白,并且具有与SKOV3细胞和MNS蛋白结合的特性。结论成功建立昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白的技术平台,表达产物TCRγ9/δ2-Fc可以在体外模拟TCRγδ识别抗原的特性。

禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白的哺乳动物细胞表达系统表达及鉴定

利用哺乳动物细胞表达系统对禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白进行表达,并检测所表达融合蛋白的抗原性。首先将N基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组真核表达载体,然后将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,通过倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜检测N蛋白的表达,并用Western blot检测表达蛋白的抗原性。结果显示,禽偏肺病毒核衣壳N蛋白主要表达在细胞浆中,在转染后48h后表达量最高;与抗N蛋白抗体有抗原性,所表达核衣壳N融合蛋白大小为72kDa左右,与预期结果一致。结论,本试验成功应用哺乳动物表达系统表达了禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白,表达蛋白具有抗原性,为与禽偏肺病毒核衣壳N蛋白的相关研究奠定了基础。

昆虫细胞杆状病毒表达系统表达重组人类ZP3蛋白的研究

目的：探讨利用重组表达系统制备重组人类ZP3（hZP3）蛋白的方法和技术难点,为hZP3蛋白的制备和应用打下技术基础。方法：构建hZP3的载体质粒pFASTBAC HTa-hZP3,在大肠杆菌宿主细胞中利用杆状病毒Bac-to-Bac系统同源重组构建重组的杆状病毒穿梭载体Bacmid,用重组的Bacmid转染Sf9细胞制备重组杆状病毒,分别表达带HIS标签的h ZP3全长蛋白（氨基酸1-424）和截短的hZP3蛋白（氨基酸23-348）。摸索重组hZP3蛋白的表达时间和纯化制备方法。结果：成功制备了表达重组人hZP3全长蛋白和截短体蛋白的Bacmid和杆状病毒颗粒,Western印迹检测表明,在Sf9细胞中较好的表达时间段为感染后72-96 h。重组表达的hZP3蛋白可以部分被钴柱亲和纯化,大量的重组hZP3蛋白不能结合到亲和介质而流穿,但确切的原因还未知。纯化得到的hZP3经荧光素Dylight Dye488标记,能与人精子结合。结论：利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达hZP3蛋白是可行的,可以进一步优化,但hZP3蛋白的有效富集和纯化方法是最大的瓶颈,还需要进一步摸索。

利用柞蚕核型多角体病毒表达系统表达谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶

谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT)是己糖胺生物合成途径(HBP)中的限速酶,与蛋白质糖基化修饰密切相关。本研究克隆的柞蚕GFAT基因(ApGFAT)CDS由2 022个碱基构成,编码674个氨基酸。将该基因连接到柞蚕杆状病毒转移载体pApM748BE后与ApNPV-Δph/egfp+共转染Tn-High Five细胞获得重组病毒。将重组病毒注射到柞蚕蛹体内,收集发病蛹血淋巴,用镍离子螯合柱纯化得到纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测表明,ApGFAT蛋白在柞蚕蛹体内得到成功表达,酶活力为0.978μmol/(min·mg)。

硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素之纯化和生物学活性鉴定

目的:将硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素(endostatin)进行纯化并对其生物学活性进行测定.方法:将含有pThioHis-endo重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.将纯化的蛋白质通过鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和内皮细胞抑制实验对纯化的蛋白质进行生物学活性测定.结果:经SDS-PAGE电泳分析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L.纯化的重组蛋白在体外能抑制鸡胚囊膜血管生成及具有抑制血管内皮细胞增殖的活性,加入重组蛋白内皮抑素5μg组与10μg组血管生成抑制率分别为(22.3±2.0)%和(47.1±4.0)%,P<0.05,和对照组经过方差分析,差异都有显著性意义;内皮细胞抑制实验可见不同剂量重组蛋白内皮抑素对内皮细胞的生长具有抑制作用[抑制率分别为(49.6±4.1)%,(53.2±2.3)%,(55.0±3.6)%,(67.1±5.7)%],经过方差分析和相关性分析,具有剂量依赖效应(r=0.984,P<0.05).结论:用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素

目的利用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素(endostatin)。方法采用PCR技术从pMFGendo质粒上扩增出小鼠endostatin完整的cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定。结果高效表达出相对分子量约32KD的重组融合蛋白,灰度扫描软件分析显示,其表达量占菌体总蛋白质的35.9%,经镍柱亲和层析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L。结论用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性。

利用杆状病毒系统表达重组HBV聚合酶RT区段

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组HBV聚合酶RT区段蛋白。方法构建含有HBV P基因RT区段的杆状病毒转移载体pFastBac HT-RT,转化大肠埃希菌DH10B-ac进行重组,提取重组Bacmid DNA质粒,转染昆虫细胞Sf9获得含有HBVP基因RT区段的重组杆状病毒。重组的杆状病毒再感染Sf9细胞进行HBVP基因RT区段蛋白表达,通过Western blot检测表达情况。结果成功构建了含HBV P基因RT区段的重组杆状病毒,昆虫细胞Sf9中能检测到HBV P基因RT区段蛋白的表达。结论利用杆状病毒表达系统能成功地表达HBVP基因RT区段蛋白。

酵母表达系统表达外源基因的研究进展

阐述了几种常用的酵母表达系统的研究现状及应用前景，并对酵母分泌的外源蛋白的含量及糖基化程度进行了比较．我们认为：甲醇营养型酵母分泌的外源蛋白量高且无过度糖基化现象。