2种抗生素对大黄鱼肠道组织及紧密连接蛋白基因表达的影响

为探究盐酸多西环素和恩诺沙星对大黄鱼肠道结构及肠道紧密连接蛋白相关基因表达的影响,在水温16.80~22.50℃下,将体质量(41.57±1.63)g的大黄鱼饲养在直径1 m、水深1.25 m的圆形塑料水槽中,投喂剂量0、0.2、1.0、2.0 g/kg的药饵5~7 d,停药后1、5、15 d,观察肠道组织形态变化,测定紧密连接蛋白基因Claudin-7、ZO-1和Occludin的相对表达量。试验结果显示:大黄鱼摄食2种药物后,肠道均出现肠绒毛萎缩,组织空泡化等病变,随着给药剂量的增加和给药时间的延长,肠道组织损伤程度逐渐加深,紧密连接蛋白基因表达量持续降低;肠黏膜损伤在停药15 d后仍未恢复至对照组水平,药物剂量越高恢复程度越低;与对照组相比,2种药物高剂量组紧密连接蛋白基因表达量在停药15 d后仍显著低于对照组(P<0.05),其余组无显著差异(P>0.05)。试验结果表明,盐酸多西环素和恩诺沙星以剂量时间依赖方式损伤大黄鱼肠道组织,降低肠道通透性,药物剂量越高,恢复周期越长,在15 d后仍未完全恢复。

胰高血糖素样肽-2对断奶仔猪肠上皮紧密连接蛋白相关基因表达的影响

本文旨在研究胰高血糖素样肽-2(GLP-2)对离体培养的断奶仔猪空肠上皮紧密连接蛋白相关基因表达的影响,探讨GLP-2调节肠道黏膜屏障的可能机制。将断奶仔猪空肠组织块置于含0、1×10-8、1×10-7mol/L的GLP-2的细胞培养液中进行培养,考察不同GLP-2添加水平对断奶仔猪空肠上皮丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路细胞外调节蛋白激酶丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2(MEK1/2)、p90核糖体S6蛋白激酶(p90RSK)以及紧密连接蛋白ZO-1、Oc-cludin、Claudin-1基因表达的影响,待确定出GLP-2能有效促进紧密连接蛋白相关基因表达的剂量后,再向培养液中添加MEK1/2的特异性阻断剂U0126,考察阻断MAPK经典通路后紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的基因表达的变化。结果表明,与对照组相比,将空肠组织块置于含1×10-7和1×10-8mol/L GLP-2的培养液中培养72 h均能显著促进MEK1/2、p90RSK以及紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的基因mRNA相对表达量(P<0.05),除ZO-1的基因之外,上述各蛋白的基因mRNA相对表达量还随着GLP-2浓度的增高而升高(P<0.05);向1×10-7mol/L的GLP-2组添加U0126阻断p90RSK、ERK1/2的基因表达后,紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的基因mRNA相对表达量也显著下降(P<0.05)。由此可知,GLP-2能够促进断奶仔猪空肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的基因表达,而MAPK通路可能是GLP-2调控肠道紧密连接蛋白基因表达的重要信号通路之一。

野大麦肌动蛋白基因片段的克隆及其表达特征分析

野大麦(Hordeum brevisubulatum)是重要的野生禾本科牧草,具有多种抗逆性。为深入挖掘野大麦的抗逆基因,本研究以RT-PCR法克隆了野大麦肌动蛋白基因(Actin,ACT)的核心片段。采用BLAST序列比对,qRT-PCR实时定量方法对其序列特征和表达特性进行了分析。结果表明,野大麦ACT的基因片段长518 bp,编码171个氨基酸。BLAST分析表明,野大麦的肌动蛋白基因片段与大麦(Hordeum vulgare)ACT基因核苷酸序列的一致性达97%,与ACT蛋白氨基酸序列的同源性达91%,并将其命名为HbACT。与11种相关植物进行ACT氨基酸序列比对发现,HbACT含152个保守氨基酸和19个非保守氨基酸,说明HbACT蛋白具有高度保守性。qRT-PCR分析表明,在不同盐浓度处理条件下,不同处理时间野大麦各器官的HbACT的Ct平均值为19.30,地上部的变异系数为3.5,峰度系数为0.262;地下部的变异系数为5.3,峰度系数为0.409,均属于尖峰分布,Ct值的稳定系数均小于1.7。综上所述,HbACT基因表达稳定,可作为内参基因用于研究野大麦功能基因的表达模式分析。

可溶性生长刺激表达基因2蛋白对脓毒症相关急性肾损伤的预测价值

目的研究可溶性生长刺激表达基因2蛋白(soluble growth-stimulated expressed gene 2 protein,sST2)对脓毒症相关急性肾损伤(sepsis-associated acute kidney injury,SA-AKI)的预测价值。方法采用回顾性观察性研究,纳入2020年1月至2023年12月在南通大学附属医院急诊科接受sST2检测的395例脓毒症患者。根据是否发生急性肾损伤(AKI),分为非AKI组(281例)和AKI组(114例)。收集患者入院24 h内的基础临床数据和实验室检查结果,通过受试者工作特征(ROC)曲线分析sST2对SA-AKI的诊断能力,logistic回归评估sST2是否为SA-AKI发生的独立危险因素,通过构建两预测模型,使用ROC曲线下面积(AUC)、净重新分类指数(NRI)、综合判别改善指数(IDI)评估sST2的加入对模型预测能力的提升效果。结果AKI组患者sST2水平高于非AKI组(P<0.001)。sST2诊断SA-AKI的AUC为0.839(0.799~0.874),显著高于其他实验室指标(P<0.0001)。sST2>85 ng/mL是SA-AKI的独立危险因素(OR=14.315,95%CI:5.867~34.926,P<0.001)。增加sST2显著改善了预测模型的AUC(0.954 vs.0.909,P<0.0001)、NRI(21.48%,95%CI:11.48%~31.49%,P<0.0001)及IDI(8.62%,95%CI:5.75%~11.49%,P<0.0001)。结论血清sST2可能成为潜在的预测脓毒症AKI发生的生物标志物。

茶多酚对乳鸽十二指肠形态发育、抗氧化功能和紧密连接蛋白基因mRNA表达的影响

试验旨在探究饲粮添加茶多酚对乳鸽十二指肠形态发育、抗氧化功能及紧密连接蛋白基因mRNA表达量的影响,为茶多酚作为功能性饲料添加剂在养鸽生产中的合理应用提供理论依据。选取初始体重一致、健康1日龄仔鸽240只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复10只仔鸽。对照组饲喂基础饲粮,茶多酚低、中、高剂量组分别在基础饲粮中添加100、200和400 mg·kg^(-1)茶多酚,试验期28 d。试验结束后,采集乳鸽十二指肠组织进行肠道形态发育、抗氧化功能以及紧密连接蛋白基因表达测定。结果表明,与对照组相比,中剂量茶多酚极显著提高乳鸽十二指肠绒毛高度(VH)、隐窝深度(CD)、提高绒隐比(VH/CD)(P<0.01),高剂量茶多酚极显著提高乳鸽十二指肠绒毛高度和隐窝深度(P<0.01);低剂量茶多酚极显著降低乳鸽十二指肠丙二醛(MDA)含量(P<0.01),中剂量茶多酚极显著降低乳鸽十二指肠MDA含量和乳酸脱氢酶(LDH)活性(P<0.01),高剂量茶多酚极显著提高乳鸽十二指肠总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低MDA含量和LDH活性(P<0.01),3个剂量茶多酚均极显著提高SOD2基因mRNA表达量(P<0.01),高剂量茶多酚还极显著提高过氧化氢酶(CAT)基因mRNA表达量(P<0.01);此外,低剂量茶多酚极显著提高Occludin、降低Claudin-2 mRNA表达量(P<0.01),中剂量茶多酚极显著提高Occludin和ZO-1并降低Claudin-2 mRNA表达量,高剂量茶多酚极显著提高Occludin和ZO-1基因mRNA表达量,显著提高Claudin-3基因mRNA表达量(P<0.05)并极显著降低Claudin-2 mRNA表达量(P<0.01)。综上所述,饲粮添加茶多酚可以通过改善乳鸽十二指肠肠道发育、提高肠道抗氧化能力和调节肠道紧密连接蛋白相关基因mRNA表达量进而维持乳鸽肠道健康。

饲粮添加茶多酚对马岗鹅空肠组织形态、抗氧化能力及紧密连接蛋白相关基因表达的影响

本试验旨在探究饲粮中添加茶多酚(TP)对70日龄马岗鹅肠道组织形态、抗氧化能力及紧密连接蛋白相关基因表达的影响。试验选取体重基本一致、健康的28日龄马岗鹅240只(公母各占1/2),随机分为4组,分别饲喂添加0(对照)、100(低剂量)、500(中剂量)和1000 mg/kg(高剂量)茶多酚(纯度为98.7%)的试验饲粮,每组6个重复,每个重复10只。预试期1周,正试期5周。结果表明:1)与对照组相比,饲粮添加500 mg/kg茶多酚显著提高马岗鹅空肠绒毛高度(P<0.05);饲粮添加100和500 mg/kg茶多酚显著降低空肠隐窝深度(P<0.05),并显著提高空肠绒隐比(V/C)(P<0.05)。2)与对照组相比,饲粮添加500和1000 mg/kg茶多酚显著提高空肠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性以及谷胱甘肽过氧化物酶2(GPX2)活性(P<0.05);饲粮添加100和500 mg/kg茶多酚显著降低空肠丙二醛(MDA)含量(P<0.05);各添加剂量茶多酚均显著降低空肠乳酸脱氢酶(LDH)活性(P<0.05)。3)与对照组相比,饲粮添加500和1000 mg/kg茶多酚均显著提高空肠与抗氧化能力相关基因超氧化物歧化酶1(SOD1)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)、GPX2和血红素氧合酶-1(HO-1)的mRNA相对表达量(P<0.05)。4)与对照组相比,饲粮添加500和1000 mg/kg茶多酚显著提高空肠紧密连接蛋白相关基因闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白-5(Claudin-5)和咬合蛋白(Occludin)的mRNA相对表达量(P<0.05);各添加剂量茶多酚均显著提高空肠E钙黏连蛋白(E-cadherin)的mRNA相对表达量(P<0.05)。由此可见,饲粮添加一定剂量的茶多酚可以促进马岗鹅空肠的形态发育,提高空肠的抗氧化能力以及肠壁紧密连接的程度。综合考虑,在70日龄马岗鹅饲粮中茶多酚的推荐添加量为500 mg/kg。

唾液腺腺泡细胞癌中NR4A3基因重排及NOR-1蛋白表达分析

目的:探讨NR4A3基因重排和NOR-1蛋白表达在唾液腺腺泡细胞癌中的表达及在鉴别诊断中的价值。方法:收集2020年5月—2024年1月于上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔病理科诊断的唾液腺癌119例,包括腺泡细胞癌(acinic cell carcinoma,AciCC)63例,黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)31例,分泌性癌(secretory carcinoma,SC)25例。分别使用荧光原位杂交和免疫组织化学染色检测NR4A3基因重排和NOR-1蛋白表达情况,采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果:AciCC主要发生于大唾液腺。与MEC和SC相比,AciCC好发于女性(P=0.006)。NR4A3基因重排在AciCC、MEC和SC中的阳性率分别为76.2%(48/63)、0%(0/10)和0%(0/7),NOR-1蛋白表达在AciCC、MEC和SC中的阳性率分别为92.1%(58/63)、9.7%(3/31)和0%(0/25),差异具有统计学意义(P<0.001)。单独使用NR4A3基因重排诊断AciCC时,灵敏度和特异度分别为76.2%和100%。单独使用NOR-1蛋白表达诊断AciCC时,灵敏度和特异度分别为92.1%和94.6%。联合使用NR4A3基因重排和NOR-1蛋白表达诊断AciCC时,灵敏度和特异度分别为96.8%和94.6%,曲线下面积为0.896,诊断价值最优。结论:AciCC好发于女性,主要发病部位为大唾液腺。NR4A3基因重排仅见于AciCC中,在诊断工作中具有100%的特异性,但敏感性较低。NOR-1蛋白表达检测具有很好的灵敏度和特异度,可作为鉴别AciCC、MEC和SC的初筛和替代方法。联合使用NR4A3基因重排和NOR-1蛋白表达检测具有最优的诊断价值。

老年舒张性心力衰竭合并肌少症患者可溶性生长刺激表达基因2蛋白、肌红蛋白、白细胞介素-6水平与心功能的相关性

目的 探讨老年舒张性心力衰竭(DHF)合并肌少症患者外周血可溶性生长刺激表达基因2蛋白(sST2)、肌红蛋白(Myo)、白细胞介素-6(IL-6)水平与心功能的相关性。方法 将122例DHF患者根据有无肌少症分为DHF合并肌少症组60例和DHF组62例,另将健康体检者58例、单纯肌少症患者60例分别纳入对照组、单纯肌少症组,检测各组外周血sST2、Myo、IL-6水平和心功能指标[左室射血分数(LVEF)、心排血量(CO)、心率(HR)、每搏输出量(SV)和心脏指数(CI)]。采用Pearson相关分析法分析sST2、Myo、IL-6与各心功能指标的相关性。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析sST2、Myo、IL-6单独及联合诊断DHF合并肌少症的效能。结果 与对照组、单纯肌少症组相比,DHF组、DHF合并肌少症组sST2、Myo、IL-6水平和HR均升高,LVEF、CO、SV和CI均降低,差异有统计学意义(P<0.05);与DHF组相比,DHF合并肌少症组sST2、Myo、IL-6水平和HR均升高,LVEF、CO、SV和CI均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。sST2、Myo、IL-6均分别与LVEF、CO、SV、CI呈负相关(P<0.001),均与HR呈正相关(P<0.001);sST2、Myo、IL-6、LVEF、SV是DHF合并肌少症的独立影响因素(P<0.05);sST2、Myo、IL-6联合诊断DHF合并肌少症的曲线下面积为0.936,诊断效能优于三者单独检测。结论 老年DHF合并肌少症患者外周血sST2、Myo、IL-6水平显著升高,且sST2、Myo、IL-6均与心功能指标显著相关,三者联合检测对DHF合并肌少症的诊断效能较高。

膀胱癌100例血清Zeste基因增强子同源物2和信号传导蛋白3表达水平及诊断价值分析

目的探讨膀胱癌病人血清Zeste基因增强子同源物2(EZH2)和信号传导蛋白3(SMAD3)表达水平及临床意义。方法纳入江苏省人民医院宿迁医院于2021年1月至2022年12月收治的膀胱癌病人进行研究(100例),另选取同期于该院就诊的泌尿系统良性疾病病人作为良性疾病组(93例)以及健康体检者作为对照(100例)。采用Pearson相关性分析法分析膀胱癌病人血清中EZH2和SMAD3表达水平的相关性;采用logistic多因素回归分析法分析膀胱癌发生的影响因素;采用ROC曲线分析EZH2和SMAD3对膀胱癌的诊断效能。结果膀胱癌病人血清中EZH2(101.34±15.09)ng/L和SMAD3(226.53±25.94)ng/L表达水平均高于良性疾病组(85.96±11.23)ng/L、(203.11±22.18)ng/L和对照组(83.91±9.14)ng/L、(198.03±20.30)ng/L(均P<0.001);膀胱癌病人血清EZH2和SMAD3表达水平呈正相关(r=0.72,P<0.001);膀胱癌组年龄≥60岁(74/187)、有吸烟史的病人(76/166)所占比例均高于良性疾病组(65/187、55/166)及对照组(48/187、35/166)(均P<0.05);年龄、吸烟史、EZH2、SMAD3为发生膀胱癌的危险因素(P<0.05);以良性疾病组为对照,血清EZH2和SMAD3单独检测诊断膀胱癌的曲线下面积(AUC)分别为0.78、0.78,二者联合检测的AUC为0.85,优于各自单独检测(Z_(二者联合-EZH2)=2.81、Z_(二者联合-SMAD3)=2.68,P=0.009、0.007)。结论血清EZH2和SMAD3与膀胱癌的发生有关,二者联合对膀胱癌具有一定的诊断价值。

溶血素 E基因原核表达载体的构建与蛋白诱导表达

目的构建大肠杆菌(Escherichia Coli,E.coli)溶血素E(Hemolysin E)基因的重组质粒pCZN1-hlyE,诱导表达目的蛋白。方法通过NCBI数据库检索获取E.coli Hemolysin E基因序列(NC_000913.3),采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的全基因合成法,设计全长拼接引物,合成目的基因,并成功构建重组质粒pCZN1-hlyE。将构建好的pCZN1-hlyE重组质粒转入大肠杆菌TOP10菌株中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Hemolysin E基因的表达,生成Hemolysin E毒力蛋白。结果经SDS-PAGE凝胶电泳,Western blot分析鉴定目的蛋白Hemolysin E分子量为28.72 kDa,与Hemolysin E基因核酸序列经DNAMAN软件分析所得蛋白分子量一致。结论被诱导表达的Hemolysin E蛋白存在于菌体裂解液上清中,并纯化制备重组蛋白。

纺锤体蛋白、锌指转录因子和紧密连接蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系

目的 分析胃癌病人癌组织中纺锤体蛋白(SPIN1)、锌指转录因子(Slug)和紧密连接蛋白(Claudin-1)三种蛋白的表达情况与其临床病理特征的相关性。方法 选取贵州医科大学附属医院2019年6月至2021年7月确诊并收治的84例胃癌病人,按照分期分为对照组(早期胃癌)和实验组(晚期胃癌)两组,使用ELISA检测胃癌组织中的SPIN1、Slug和Claudin-1三种蛋白表达情况并分析其间的关系。结果 两组病人在一般资料上差异无统计学意义(P>0.05),在年龄、饮酒史和胃部疾病上差异有统计学意义(P<0.05),实验组胃癌病人SPIN1和Slug显著高于对照组胃癌病人(P<0.05),且实验组Claudin-1显著低于对照组胃癌病人(P<0.05),对照组和实验组的肿瘤长径[≥5 mm:4(9.52%)比32(76.19%)]、是否存在淋巴结转移[阳性:5(11.90%)比37(88.10%)]之间均差异有统计学意义(P<0.05)。结论 胃癌病人SPIN1、Slug和Claudin-1的表达情况与胃癌分期和肿瘤长径与临床病理特征之间存在一定相关性。

河虾过敏原原肌球蛋白的基因克隆与原核表达

为了探寻天然原肌球蛋白的可替代物作为诊断和治疗虾类过敏的基础材料,本研究从河虾中提取总RNA,利用cDNA末端快速扩增技术克隆河虾过敏原原肌球蛋白基因的全长序列。以此序列设计表达引物,构建表达载体,最后通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组原肌球蛋白。结果显示,河虾的原肌球蛋白基因cDNA序列全长1658 bp,开放阅读框855 bp,编码284个氨基酸,预测蛋白等电点4.70,预测分子质量32.8 kDa。河虾原肌球蛋白cDNA序列已上传至GenBank数据库,登录号为OP974621。本研究成功构建河虾原肌球蛋白重组表达质粒pET-30a-TM,并用IPTG进行体外诱导表达,最佳诱导条件为IPTG浓度1 mmol/L、37℃诱导4 h。可溶性分析结果表明重组原肌球蛋白主要以可溶性形式存在于细胞破碎液的上清液中,分子质量约38 kDa。

不同来源胰蛋白酶的基因挖掘、在Komagataella phaffii GS115的异源表达及其酶学性质分析

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,广泛应用于皮革、食品加工、生化检测和制药行业。该文旨在挖掘不同来源的胰蛋白酶,并在Komagataella phaffii GS115进行异源表达,最终分析并比较其酶学性质。通过基因挖掘手段分别克隆了人源胰蛋白酶(homo spanies trypsin,HST)、牛源胰蛋白酶(bos taurus trypsin,BTT)、虾源胰蛋白酶(penaeus vannamei trypsin,PVT)和弗氏链霉菌源胰蛋白酶(Streptomyces fradiae trypsin,SFT),以pPIC9k为载体构建重组质粒,并在Komagataella phaffii GS115中成功实现异源表达。经纯化激活后,HST,BTT,PVT,SFT的酰胺酶活性分别为18.6、12.3、44.7、13.8 U/mL;4种来源胰蛋白酶的最适温度分别为20、35、40、45℃,而其最适pH值分别为9、8.5、8.5、9,其中SFT在pH 9~11的稳定性更优。

橡胶树硫氧还蛋白基因HbTRXo2克隆、表达及功能分析

硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)作为氧化还原调节蛋白在植物抵御非生物逆境胁迫中发挥重要作用。本研究采用RT-PCR从橡胶树(Heveabrasiliensis)中克隆了硫氧还蛋白基因HbTRXo2,该基因编码区长594bp,编码197个氨基酸。预测HbTRXo2蛋白的分子量为21.90 kDa,理论等电点为7.59。蛋白保守结构域和系统进化分析结果显示,HbTRXo2含有TRX保守结构域,与其他植物o型硫氧还蛋白聚在一起,表明该蛋白属于o型硫氧还蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,HbTRXo2基因在橡胶树根、树皮、胶乳、成熟叶、衰老叶、新梢、雌花和雄花组织中均表达,其中在胶乳中的表达量显著高于其他组织。同健康橡胶树相比,割面干涸橡胶树树皮和胶乳中HbTRXo2的表达量显著降低。在低温、聚乙二醇(PEG)诱导的干旱以及过氧化氢(H_(2)O_(2))和甲基紫精(MV)诱导的氧化胁迫处理下,HbTRXo2基因的表达显著上调,表明该基因参与了橡胶树对非生物胁迫的应答。为了研究HbTRXo2在抗逆中的功能,本研究构建其酵母表达载体,并转入酿酒酵母INVSc1菌株中,获得重组酵母INVSc1(pYES2-HbTRXo2)。比较重组酵母INVSc1(pYES2-HbTRXo2)和转空载体对照酵母INVSc1(pYES2)在H_(2)O_(2)、PEG和低温胁迫处理后的存活差异。结果显示,重组酵母INVSc1(pYES2-HbTRXo2)在PEG和H_(2)O_(2)处理后的存活率明显高于对照酵母,而在低温胁迫处理后的存活率明显低于对照酵母,表明转HbTRXo2基因提高了重组酵母对干旱和氧化胁迫的抗性,但降低了对低温胁迫的抗性。以上研究结果证明,HbTRXo2在橡胶树产排胶和抗逆过程中起着重要作用。本研究为进一步解析HbTRXo2在橡胶树中的生物学功能提供重要的参考依据。

番茄组蛋白修饰基因家族鉴定及表达分析

【目的】植物组蛋白的功能修饰包括乙酰化修饰和甲基化修饰,在植物生长发育及逆境响应的过程中发挥着重要作用。番茄组蛋白修饰(Histone modification,HM)基因家族的生物学功能及分子机制尚不清楚,该文旨在进一步明确番茄HM基因的生物学功能,为其分子机制研究及番茄遗传改良奠定基础。【方法】基于番茄基因组数据库鉴定番茄HM成员,利用生物信息学的方法系统分析其HM基因家族成员的系统进化、基因结构、染色体定位,通过在线转录组数据分析番茄HM基因家族时空表达模式。【结果】共鉴定到148个番茄HM基因,其中32个编码组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltransferase,HAT),11个编码组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC),50个编码组蛋白甲基转移酶(Histone methyltransferase,HMT),55个编码组蛋白去甲基化酶(Histone demethylase,HDM)。148个基因不均匀地分布在12条染色体上,其中3号染色体上分布最多、有21个基因,12号染色体上分布最少、有4个基因。基因结构特征分析表明,番茄HM基因之间外显子的差异较大,最多可达34个、最少仅有1个。蛋白质结构域分析结果显示,Solyc07g064130、Solyc11g005670、Solyc10g006480仅含有Ubl结构域,Solyc07g062100、Solyc10g077110和Solyc03g083310仅含有Zn-finger结构域,另有10个成员含有Bromo结构域、48个成员含有SET结构域,其他成员还包含PLN02529、PRMT5等结构域。此外,番茄HM与拟南芥和水稻中的同源蛋白关系均较远,且与水稻相比,番茄HM序列与拟南芥同源蛋白序列亲缘关系较近。根据聚类分析,将番茄HM分成HAT、HDAC、HMT、HDM 4个家族。组织表达分析表明,HAT家族在发芽后30 d的花(F30)、开花后10 d的果实(10 DPA)、花(fr)、根(rr)、未成熟的果实(Plgfr)中高表达;HDAC家族在发芽后30 d的花(F30)和未成熟果实(Plgfr)中高表达;HMT家族在发芽后30 d的花(F30)、在全株50%的花开放时的花(F45)、花蕾(br)、3 cm果实(3fr)、未成熟5 cm果实(PB+5fr)中高表达;HDM家族在发芽后30 d的花(F30)、在全株50%的花开放时的花(F45)、花蕾(br)、花(fr)、根(rr)、3 cm果实(3fr)、未成熟5 cm果实(PB+5fr)中高表达。【结论】不同番茄HM的基因结构差异较大,包含多种功能结构域。番茄HM与拟南芥、水稻HM的同源关系较远,且在植物不同生长发育阶段及不同器官组织中均有一定的表达,表明该类基因可能参与番茄多种生长发育过程。

梨小食心虫卵黄原蛋白基因的鉴定及表达分析

为明确重要果树害虫梨小食心虫(Grapholita molesta)卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)基因功能及其生殖调控机制,为GmVg基因功能的深入研究奠定理论基础,克隆鉴定了梨小食心虫卵黄原蛋白基因(GmVg)并进行生物信息学分析,通过qRT-PCR分析GmVg在梨小食心虫不同发育时期、不同性别和不同组织的表达模式。结果表明,GmVg基因全长5 573 bp,开放阅读框(ORF)5 364 bp,编码1 787个氨基酸,信号肽长度为15个氨基酸,分子式为C_(9041)H_(14090)N_(2544)O_(2743)S_(57);氨基酸组成中丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Gln)和丝氨酸(Ser)占比最大,分别为8.2%、7.9%和7.8%,酸性残基的数量(Asp+Glu)为187个,碱性残基的数量(Arg+Lys)为204个,预测蛋白质分子质量和等电点分别为204.1 ku和8.79,具有Vitellogenin-N、DUF1943和VWD共3个典型保守结构域。GmVg成虫期的表达量显著高于卵、幼虫和蛹期,且羽化后24 h时达到峰值。GmVg的表达具有性别特异性,在雄虫中表达量极低。GmVg在雌成虫头部、卵巢和脂肪体中的表达呈现组织特异性,其中脂肪体显著高表达,分别是头部和卵巢表达量的21.49倍和16.4倍。

叉角厉蝽毒液丝氨酸蛋白酶基因EfSP2克隆、表达及捕食功能分析

【目的】通过对叉角厉蝽[Eocanthecona furcellata(Wolff)]毒液丝氨酸蛋白酶(Serine protease,SP)基因EfSP2的克隆、序列分析、表达谱分析及RNA干扰(RNAinterference,RNAi),解析EfSP2蛋白的功能,为EfSP2基因的分子特征研究及功能注释提供科学依据。【方法】从叉角厉蝽唾液腺转录组中获得EfSP2基因序列,利用PCR技术扩增EfSP2基因完整开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列,对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法分析EfSP2基因在叉角厉蝽不同发育阶段(卵、1~5龄若虫和雌雄成虫)唾液腺及雌成虫不同组织(马氏管、唾液腺、脂肪体、卵巢、中肠、头)中的表达情况;通过RNAi技术检测其对叉角厉蝽雌雄成虫存活及捕食的影响。【结果】克隆获得EfSP2基因ORF序列长861 bp,编码286个氨基酸;EfSP2氨基酸序列中具有1个完整的Tryp-SPc结构域,含有胰蛋白酶N末端保守的起始氨基酸序列(IVGG);含有保守的SP三联体催化活性中心,属于丝氨酸蛋白酶家族的类胰蛋白酶亚家族;与稻绿蝽(Nezara viridula)SP同源性最高,氨基酸序列一致性为44.69%。EfSP2基因在叉角厉蝽雌雄成虫和唾液腺中有极高的表达量。注射dsEfSP2能显著抑制靶标基因的表达(P<0.05,下同),且显著降低叉角厉蝽雌雄成虫的存活率和捕食量。【结论】成功克隆了叉角厉蝽毒液丝氨酸蛋白酶EfSP2基因。时空表达谱及RNAi结果表明,EfSP2可能是叉角厉蝽生长发育、捕食和消化过程中的重要蛋白之一。

大麦核仁蛋白基因HvNOP58的克隆和表达分析

Nop(nucleolar protein)结构域蛋白可参与核糖体装配、核苷酸甲基化修饰、基因表达调控等生物进程,是制约真核生物发育遗传、细胞周期调控和衰老机制等研究的关键因素,但少有大麦Nop结构域核仁蛋白基因的报道。本研究以北青7号和Ynbs突变体为材料,克隆了大麦HvNOP58基因的CDS序列。结果表明,HvNOP58基因位于大麦Chr2H基因组负链的49019790~49023604 bp区间,具有10个外显子,编码区长度为1674 bp。所编码蛋白属于亲水性的稳定蛋白,其高级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,具有N端结构域、NOSIC结构域和Nop结构域。同源比对和系统进化分析表明,HvNOP58蛋白与同族物种的核仁蛋白具有更近的亲缘关系。亚细胞定位、RT-PCR检测和荧光定量检测结果表明,HvNOP58基因定位于细胞核,在叶、茎、幼穗、根和叶鞘5种组织中有表达。

基于Fosmid文库筛选山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因及其表达验证

【目的】利用Fosmid文库功能筛选法,获得山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因并进行原核表达。【方法】利用功能底物筛选法从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选具有蛋白酶活性的克隆子,对其进行Illumina二代测序,对预测到的基因进行功能注释,根据基因丰度结果确定后续研究的功能基因。利用大肠杆菌BL21(DE3)对功能基因进行诱导表达,对表达产物进行酶活性测定。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,将密码子优化后的功能基因分别敲入枯草芽孢杆菌C6基因组ctc位点并进行表达验证。【结果】从Fosmid文库1700个克隆子中筛选到1个具有蛋白酶活性的阳性克隆Pro4-C5。通过二代测序技术,鉴定出3个潜在的蛋白酶基因gene0833(内肽酶,EC编号:EC3.4.21.53)、gene0196(金属内肽酶,EC编号:EC3.4.24)和gene0585(羧肽酶,EC编号:EC3.4.17.14)以及1个L-天冬酰胺酶基因(gene0683,EC编号:EC3.5.1.1)。以pET-28a(+)为表达载体,通过大肠杆菌BL21(DE3)原核诱导表达发现,gene0585和gene0196未表达;gene0833表达的蛋白分子质量为87 ku,蛋白酶活性为10.45 U/mL;gene0683表达的蛋白分子质量为37 ku,L-天冬酰胺酶活性为88.52 U/mL,同时发现该蛋白也具有蛋白酶活性,酶活性为5.25 U/mL。将密码子优化后的gene0683和gene0833定点敲入枯草芽孢杆菌C6基因组中表达发现,gene0833未表达,gene0683表达的蛋白酶活性为109.72 U/mL,相比原始菌株(100.97 U/mL)显著提高了8.67%(P<0.01);L-天冬酰胺酶活性为31.63 U/mL,相比原始菌株(22.79 U/mL)显著提高了30.06%(P<0.01)。【结论】从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选和鉴定出了2个具有蛋白酶活性的功能基因(gene0833和gene0683),均来源于微小杆菌属(Exiguobacterium),其中gene0683在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达产物具有较高的蛋白酶和L-天冬酰胺酶酶活性。

山药DoWRKY40基因表达特征分析及互作蛋白筛选

【目的】WRKY作为植物特异型转录因子,参与植物生长发育过程。克隆山药DoWRKY40基因,分析其表达模式,通过酵母双杂交技术筛选与DoWRKY40互作的蛋白,探究WRKY40在山药膨大过程中的调控机制。【方法】以‘大和长芋’山药为材料克隆DoWRKY40基因,并进行生物信息学分析、表达模式分析、亚细胞定位,构建山药块茎不同发育时期酵母文库,筛选与DoWRKY40互作蛋白。【结果】DoWRKY40的开放阅读框长为927 bp。DoWRKY40蛋白属于WRKY家族的第II组,含有一个典型的WRKY转录因子保守结构域,定位于细胞核。与几内亚薯蓣亲缘关系较近。DoWRKY40基因在山药块茎生长发育的120 d表达量最高,且在叶、茎和块茎中均有表达,具有组织特异性。山药cDNA文库的库容量为1.484×10^(8);pGBKT7-WRKY40诱饵载体无自激活活性。酵母双杂交法从山药文库中筛选到4类与DoWRKY40相互作用的蛋白,分别参与植物生长发育、细胞周期调节与细胞扩增、信号转导及环境胁迫应答等。【结论】克隆得到DoWRKY40基因,其响应山药的生长发育过程,筛选到的4类互作蛋白表明其在山药细胞膨大及信号转导中起调控作用。