左旋四氢巴马亭生物转化为左旋紫堇达明的研究

对链霉菌等 10株菌种进行筛选 ,发现灰色链霉菌 (Streptomycesgriseus)YD 0 0 7菌株将左旋四氢巴马亭转化为左旋紫堇达明的转化率较高。通过碳、氮源筛选、正交实验 ,得到最佳培养基配方为 :玉米粉 30g ,黄豆粉 10g ,酵母粉 5g ,K2 HPO4 2g ,NaCl 5g ,蒸馏水 10 0 0ml,pH7.0 ;转化率从 6 .0 3%提高到 17.0 0 %。研究了转化温度和时间对转化率的影响 ,同时比较了链霉菌细胞在不同转化液中的转化率 ,并选用不同pH磷酸缓冲液 ,确定转化最适pH为pH5 .0。

左旋紫堇达明对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及机制研究

建立坐骨神经慢性压迫损伤诱导的大鼠神经病理性疼痛模型(CCI模型),探讨左旋紫堇达明(levo-corydalmine,l-CDL)对神经病理性疼痛大鼠痛觉敏化和脊髓中枢敏化的影响。Von-frey法检测机械性缩足反射阈值;热痛刺激仪检测热刺激缩足反射潜伏期;免疫印迹法检测大鼠脊髓L4-L6段N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚基磷酸化水平;免疫荧光法检测脊髓背角降钙素基因相关肽(CGRP)蛋白表达以及c-fos阳性神经元数目。结果显示,l-CDL(7.5,15 30 mg/kg,ig)能够剂量依赖性地改善CCI模型大鼠机械超敏和热痛过敏。l-CDL[15 mg/(kg·d),5 d,ig]能显著抑制CCI模型大鼠脊髓CGRP,p-NR1,c-fos的高表达,且不发生镇痛耐受现象。表明l-CDL对CCI模型大鼠神经病理性疼痛具有良好的镇痛作用,其镇痛机制与抑制大鼠脊髓中枢敏化相关。

生物转化合成左旋紫堇达明诱导剂筛选及优化

目的:左旋紫堇达明为中药延胡索中痕量高效镇痛活性成分,灰色链霉菌(Streptomyces griseus ATCC 13273)具有生物转化左旋四氢巴马汀产生左旋紫堇达明的转化活性。筛选合适的生物转化诱导剂并优化诱导条件,提高左旋紫堇达明的转化产率。方法:以左旋紫堇达明的转化产率为指标,选用苯甲酸、正己烷、苯巴比妥钠作为诱导物,筛选合适的诱导物并优化转化体系诱导条件。结果:苯甲酸、正己烷、苯巴比妥钠均能显著提高左旋紫堇达明的转化产率。结论:正己烷廉价易得且不影响转化产物分离,适合工业化生产使用,为该转化体系的合适诱导剂。

LC-MS/MS法测定大鼠血浆中的左旋紫堇达明及其药代动力学研究

目的建立快速、灵敏的LC-MS/MS分析方法定量测定大鼠血浆中左旋紫堇达明（L-CDL）的浓度,经系统方法学验证后,应用于该药的大鼠药代动力学研究。方法以普萘洛尔为内标,以水（含0.1%甲酸与5 mmol/L的甲酸铵）和乙腈（含0.1%甲酸）为流动相,血浆样品中的L-CDL和内标经C18（2.1 mm×750 mm,3μm）柱分离后,质谱电喷雾离子化源（ESI）正离子多反应监测（MRM）方式分别对离子对m/z 342？192.1和m/z 260？116.2进行检测。方法验证包括专属性、标准曲线与定量下限、批内和批间精密度、准确度、基质效应、提取回收率、稳定性。结果 L-CDL在大鼠血浆样品的定量线性范围为15000 ng/ml,最低定量下限为1 ng/ml,批内和批间精密度（RSD）〈10%,回收率93.5%102.8%,基质效应108.3%112.5%。大鼠经胃给予LCDL 10 mg/kg后的主要药动学参数Cmax、T1/2、AUC0-24分别为：（557.8±330.1）ng/ml、（7.04±3.93）h、（2408±630）h·ng/ml。结论建立的LC-MS/MS方法简便、快速、灵敏,适用于L-CDL在大鼠体内的药代动力学研究。

微生物转化左旋四氢巴马汀产生左旋紫堇达明高产菌株的紫外诱变选育

紫堇达明为中药元胡中高效、微量活性成分,灰色链霉菌(Streptomyces griseus ATCC 13273)具有转化左旋四氢巴马汀产生左旋紫堇达明的生物转化活性。本研究采用紫外诱变法对原始菌株进行诱变处理,以期获得左旋紫堇达明高产突变菌株。正交试验结果显示:孢子浓度为107个/mL,照射距离为30 cm,照射时间为30 s为最佳诱变条件。筛选得到的突变株UV-056对底物的转化率达到62.58%,左旋紫堇达明转化产率达到33.12%,分别较出发菌株提高了51.00%和67.63%。检测表明,突变株经连续传代后仍可保持较好的遗传稳定性。

定向进化CYP105D1酶提高l-THP转化活性研究

细胞色素CYP105D1是Streptomyces griseus ATCC 13273中生物转化左旋四氢巴马汀合成左旋紫堇达明的关键酶,课题组前期成功在原核体系中克隆了CYP105D1,实现了利用工程菌株生物转化合成制备左旋紫堇达明。但是,CYP105D1存在着转化活性低、酶稳定性差等缺陷,因此希望通过定向进化手段改造CYP105D1,提高左旋紫堇达明的产量。研究首先通过同源模建与分子对接的方法,预测了CYP105D1与底物相互作用的关键位点,然后选取了其中8个位点进行定点饱和突变。突变文库筛选结果与全细胞转化结果显示,突变体R98AR99A的转化率提升至原先的1. 48倍。研究通过对CYP105D1酶进行定向进化,成功提高了左旋紫堇达明的生物转化合成效率,并进一步揭示了CYP105D1与底物左旋四氢巴马汀的相互作用机制。