等离子体-紫外复合诱变选育四羟基环孢菌素衍生物高产菌株

筛选可体内转化合成环孢菌素衍生物([γ-HyMeLeu4]CyA)的高产菌株。以稀有放线菌Nonomuraea dietziae为出发菌株,采用常温常压等离子体射流和紫外照射对其进行复合物理诱变。通过该诱变方法获得了具有稳定遗传性能的菌株,其转化效率比出发菌株提高了32%左右。结果表明,等离子体诱变可有效的用于该稀有放线菌,通过等离子体-紫外复合诱变筛选得到的突变菌株可用于工业生产。

常压室温等离子体-紫外复合诱变选育新硫肽类抗生素166A高产菌株

目的通过对新硫肽类抗生素166A产生菌小单孢菌TMD166进行诱变选育研究,以期获得产166A的高产菌株。方法使用多功能等离子体诱变系统(multifunctional plasma mutagenesis system,MPMS)对出发菌株TMD166的孢子进行等离子体-紫外(MPMS-UV)复合诱变,单孢子悬液经照射处理、涂布培养后获得单菌落,并以牛津杯固体发酵高通量筛选方法对菌株进行初筛,之后对高产菌株进行摇瓶复筛,利用突变株摇瓶发酵的化学效价筛选出正突变菌株。结果对比MPMS-UV不同诱变剂量发现,MPMS105s-UV60s复合诱变剂量获得的正突变率最高,达到41.43%,相应致死率为99.88%。最终筛选出一株166A高产突变株TMD166-MU1,在培养温度为28℃、210 r/min的条件下,经过96~120 h培养后,166A产量相比出发菌株提高了7.47倍。结论采用MPMS-UV复合诱变方式,再结合牛津杯固体发酵高通量筛选方法和摇瓶复筛,可高效筛选获得166A高产菌株。

紫外线等离子体复合诱变解淀粉芽孢杆菌提高NAG产量

为提高解淀粉芽孢杆菌产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine,NAG)的能力,以实验室保藏的解淀粉芽孢杆菌BI_2(B.amyloliquefaciens BI_2)为出发菌株,选用等离子体和紫外双重复合诱变,在等离子体处理15 s和紫外处理15 s的复合诱变条件下,经葡萄糖筛选平板初筛以及摇瓶发酵复筛,筛选出一株遗传稳定的突变株BH-3-2,NAG产量可达1.23 g/L,较出发菌株提高4.1倍。比较等离子体、紫外单独诱变以及复合诱变效果,结果显示复合诱变正突变率最高,达到28%,是等离子体单独诱变的1.86倍,是紫外单独诱变的2.8倍,较单因素诱变正突变率提高明显,可以作为一种高效的诱变手段。

新型常压室温等离子体-紫外复合诱变选育埃莎霉素Ⅰ高产菌株

目的通过对埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-IA进行诱变选育研究,以期获得埃莎霉素Ⅰ高产菌株。方法使用多功能等离子体诱变系统(multifunctional plasma mutagenesis system,MPMS)对出发菌株的孢子进行等离子体和紫外复合诱变,设定不同的诱变时间处理孢子悬液,通过致死率确定合适的诱变条件,利用突变株摇瓶发酵效价筛选出正突变菌株。结果在MPMS射频功率为100W,处理距离5mm,气体流量12.5SLM,等离子体-紫外辐射时间为50s时,菌株致死率为96.08%。在此诱变条件下,以突变株的初筛效价为指标的突变率、正突变率分别达到63.96%和22.52%,复筛效价是出发菌株1.5倍以上的有5株,占复筛菌株的9%。最终筛选出一株发酵单位比出发菌株提高221%、埃莎霉素Ⅰ组分含量提高192%的正突变株IA-425。42L自动发酵罐发酵结果表明,该菌株埃莎霉素Ⅰ产量达到(2000±200)μg/m L左右。结论新型等离子体复合紫外诱变方式,可有效提高菌株的埃莎霉素Ⅰ发酵产量和组分含量。这为埃莎霉素Ⅰ的大规模发酵和临床前研究奠定了良好基础。

紫外线等离子体复合诱变赤红球菌提高红色素产量

为提高赤红球菌产红色素的能力,以实验室保藏的赤红球菌(Rhodococcus ruber YM-2)为出发菌株,采用等离子体单独诱变、等离子体连续诱变、紫外线单独诱变、紫外线等离子体复合诱变等方法,最终在等离子体连续诱变处理分别45、30 s时,经筛选得到一株遗传稳定的突变株A_2,红色素粗品产量达到1.12 g/L,相比于出发菌株提高了30.32%。同时发现等离子连续诱变比等离子体、紫外线单独诱变,或紫外线和等离子复合诱变的正突变率高,达到39.40%,等离子体连续诱变可作为一种高效的诱变手段。

常压室温等离子体结合紫外诱变筛选红霉素高产菌株

利用常压室温等离子体射流诱变(ARTP)和紫外照射对红霉素产生菌进行复合诱变,得到4株产量明显提高的突变菌株,4株菌的平均发酵效价较出发菌株提高25.2%;其中一株(12#菌株)经发酵摇瓶验证,红霉素发酵单位可达10029单位/mL,比出发菌株提高了28.6%,且遗传稳定性良好。实验证明ARTP-UV复合诱变是一种简单高效的筛选方法。

利用等离子诱变技术改造纤维素酶生产丝状真菌工业菌株

为了降低纤维素乙醇工业中的用酶成本,必须改良纤维素酶生产菌株,提高丝状真菌的纤维素酶生产效率。我们首先对草酸青霉的工业菌株进行紫外线诱变,通过纤维素双层平板初筛和摇瓶复筛,获得了纤维素降解能力有一定的提高的草酸青霉,随后再对紫外线诱变过的菌株进行等离子诱变,摇瓶培养,依据胞外蛋白浓度进行初筛,继续摇瓶复筛,得到了一株较为理想的变异菌株PQ-5,滤纸酶活(FPA)较出发株提高28.2%。这是第一次报道采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术可有效提高草酸青霉纤维素酶生产能力。

ARTP与紫外线复合诱变选育高性能绿僵菌菌株

为获得高性能的金龟子绿僵菌菌株,本研究采用常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)和紫外线复合诱变处理金龟子绿僵菌,通过比较产孢快慢和生长直径大小进行初筛,用抗紫外能力和毒力作为复筛指标选育菌株,并对育种获得的突变株进行耐热性和遗传稳定性试验,最终在ARTP 40 s和紫外120 s时筛选出一株产孢量高、耐紫外线、毒力强、遗传稳定的优良菌株AU34。该菌株产孢时间比原始菌株快,产孢量为1.63±0.22(108 cell/cm^2),较原始菌株提高了63.81%。经紫外照射5 min后,AU34存活率为3.18%,比原始菌株更耐紫外照射。并且AU34对小菜蛾的毒力强,校正死亡率为85.71%,半数致死时间(Half-lethal time,LT 50)为6.12 d。与原始菌株相比,AU34的耐热性也有较大提高。传代培养6代后,菌株AU34的产孢量无明显变化,具有良好的遗传稳定性。

常压室温等离子体-紫外复合诱变选育β-法尼烯高产菌株

【背景】大肠杆菌(Escherichia coli)由于生长性能优良、遗传背景清楚、遗传操作手段成熟,是合成β-法尼烯的合适生产菌,但其合成β-法尼烯的产量目前仍不能满足工业化生产的需求。【目的】通过诱变筛选技术选育β-法尼烯高产突变株。【方法】采用常压室温等离子体(atmosphericand room temperature plasma,ARTP)诱变技术和紫外线照射对出发菌株大肠杆菌EC-16进行复合诱变,并以异戊烯焦磷酸耐受性为选择压力进行平板初筛,之后进行摇瓶复筛,最后进行发酵罐验证。通过连续多代培养筛选到的高产突变菌株,观察其遗传稳定性。【结果】经复合诱变选育筛选出一株β-法尼烯高产突变株E.coliHVK-9,其产量高达22.1g/L,相比出发菌株提高了168.74%。【结论】采用ARTP-紫外复合诱变,再结合异戊烯焦磷酸抗性筛选的集成方法,使得诱变菌株的正突变率大大提高,可以有效地提高诱变菌株的β-法尼烯产量。突变株HVK-9作为工业化发酵生产菌种具有较好的遗传稳定性,为β-法尼烯的工业化生产和应用奠定了良好的基础。

新型复合诱变法筛选高产1,3-丙二醇菌株

为提高肺炎克雷伯氏菌生产1,3-丙二醇的能力,使用一种新型的以氮气为工作气体的等离子体复合紫外的诱变系统(MPMS-UV)对菌种进行诱变。用含有90 g/L^100 g/L 1,3-丙二醇的选择培养基进行筛选驯化,最终获得一株高产PDO且甘油利用率高的优良菌株k2。2 L批式流加发酵结果表明,该菌株PDO产量为69.71 g/L,摩尔产率为0.57 mol/mol,比原始菌株分别提高了44.7%和21%。

夫西地酸生产菌复合诱变育种及发酵培养基的优化研究

利用常压室温等离子体射流诱变和紫外照射对夫西地酸生产菌株进行复合诱变,得到3株产量明显提高的突变菌株,3株菌的平均发酵效价较出发菌株提高14%;然后,采用均匀设计实验对其中发酵效价提高最多的AU-37菌株的发酵培养基碳、氮源进行了优化,得到适合该菌株的发酵培养基优化配方为:糊精1.86%、花生饼粉2.5%、蛋白胨0.3%、氯化铵0.5%、七水合硫酸镁0.3%、硫酸钾0.6%、碳酸钙1%、pH值7.2,在优化的发酵培养基中,AU-37菌株摇瓶发酵效价较出发菌株提高33.8%,为工业化生产奠定了基础。

递推式ARTP-UV复合诱变筛选高产β-葡萄糖苷酶菌株

为了提高产酶能力,采用常压室温等离子体(ARTP)与紫外(UV)复合诱变技术对酿酒酵母G13、G21菌株进行递推式复合诱变,经过一轮ARTP诱变两轮UV诱变,摇瓶培养筛选到两株高产β-葡萄糖苷酶的菌株DeaG13D1Z2、Dma-G21D1Z2,经连续5代发酵生产试验,产酶水平可分别稳定在240.93和173.38 U/m L,是出发菌株G13、G21酶活的4.61倍和3.59倍。递推式ARTP-UV是一种有效的微生物突变育种的方法,可有效应用于微生物育种工作。

UV+ARTP复合诱变筛选MK-7高产菌株的研究

目的利用紫外(UV)和常压室温等离子体(ARTP)复合诱变技术筛选甲萘醌-7(MK-7)高产菌株。方法以产MK-7的纳豆芽孢杆菌为出发菌株,利用UV+ARTP复合诱变筛选MK-7高产菌株,并对突变菌株的遗传稳定性进行研究。结果从初筛的77株突变株中获得一株MK-7高产菌株UA31#,其产量由出发菌株的7.8 mg/L提高到20.5 mg/L,经12代传代培养性能稳定。结论通过UV+ARTP复合诱变可获得遗传稳定性良好的高产MK-7菌株。

油田采出水石油烃降解菌分离、鉴定及高通量选育复合诱变菌株

【目的】为解决石油烃类物质(Total petroleum hydrocarbons,TPHs)引起的环境污染问题,提高野生型菌株对TPHs的降解率。【方法】基于微生物修复技术,通过富集培养、初筛和复筛从油田采出水中分离TPHs优势降解菌株,经形态学、生理生化以及16S r RNA基因序列分析确定其种属。采用紫外线与等离子体复合诱变技术,以96孔板发酵法替代摇瓶培养发酵,采用以多功能酶标仪双波长紫外光谱法测定为基础的高通量筛选方法选育TPHs高效降解菌株,并通过方差分析检验突变株的遗传稳定性。【结果】经鉴定,分离自采出水的野生型菌株PW04为多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)。通过复合诱变获得了3株能够高效降解TPHs的突变菌株:S.multivorum PW04-H10、S.multivorum PW04-G9、S.multivorum PW04-A6,降解率分别为85.1%、82.7%、82.9%。遗传稳定性分析结果表明这3株菌遗传性能均稳定。【结论】经分离、诱变选育出的TPHs高效降解菌株其降解率最高达85.1%,与野生型菌株相比提高了48%,可显著降低环境中TPHs含量,有效修复原油污染环境。

柚苷酶高产菌株选育及其产酶在蜜橘果汁脱苦中的应用

为了得到1株高产柚苷酶菌株并探究其工业应用价值,从发霉的柚子皮上筛选出1株塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)MN589840,采用紫外与常压室温等离子体(atmospheric room temperature plasma,ARTP)复合诱变技术,获得突变株UA13,其柚苷酶活力可达41.524 U/mL,是原始菌株的3.06倍。对酶解条件进行探究,其酶解最适温度为40~50℃,最适pH值为5.0。利用突变株UA13发酵产酶脱苦宜昌蜜橘果汁并进行理化指标检测,当酶解约50 min时,果汁中柚皮苷含量低于柚皮苷苦阈值;当酶解时间>75 min,果汁中仅剩下少量柚皮苷。使用高效液相色谱对脱苦结果验证检测,结果显示,突变株UA13产酶可有效水解果汁中的柚皮苷,且能提高果汁风味。因此,突变株UA13具有潜在的工业应用价值,为后续实验研究奠定基础。

高产青霉素酰化酶巨大芽胞杆菌的诱变选育及产酶条件优化

【目的】选育高产青霉素G酰化酶(PGA)工业菌株。【方法】采用Li Cl-紫外线复合诱变以及常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)ATCC 14945进行处理。处理菌体涂平板后,将长出的菌落接种到液体培养基中,向培养6 h后的二代菌液中添加终浓度为0.1%的苯乙酸,28°C、250 r/min条件下诱导培养40 h。对离心后获得的上清(粗酶液)采用NIPAB法测定PGA酶活力。以PGA酶活力最高的菌株为材料,对苯乙酸最佳添加量和最佳诱导时间进行优化,采用NIPAB法测定PGA酶活力。采用SDS-PAGE检测诱变前后巨大芽胞杆菌粗酶液中PGA的蛋白特性。【结果】从诱变菌落中筛选到PGA酶活力为39.60 U/m L的菌株12-4,酶活力比出发菌株提高了8.5倍。该菌株在液体培养6 h后添加终浓度为0.2%的苯乙酸,继续培养50 h后,PGA酶活力可达78.45 U/m L,比出发菌株提高了16.8倍。诱变前后菌株培养液中的PGA蛋白均具α、β亚基;诱变后菌株PGAα亚基的量没有明显变化,β亚基的量明显增多;α、β亚基之间的蛋白条带明显增多。【结论】采用诱变技术可提高巨大芽胞杆菌PGA活性,获得的诱变菌株12-4及培养条件对PGA工业化生产具有重要价值。