东北红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA克隆及其与紫杉醇产生菌基因组DNA的Southern杂交(英文)

为进一步研究紫杉二烯合成酶的作用机理和紫杉醇生物合成代谢调控机制,采用RT-PCR技术从东北红豆杉(Taxus cuspidata)树叶中获得了紫杉二烯合成酶基因片段,将该片段克隆在载体pGEMT-easy vector上,并转化到E.coliJM109中,经EcoRI酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定,获得紫杉二烯合成酶基因片段长度为909 bp,编码303个氨基酸,与GenBank中收录的紫杉二烯合成酶的同源性达到98%;对获得的紫杉二烯合成酶基因和紫杉醇产生菌HQD33基因组DNA进行了Southern杂交。结果初步证实了紫杉二烯合成酶存在于通过内生真菌发酵生产紫杉醇的生物合成途径中。为利用分子生物学手段研究通过内生真菌发酵生产紫杉醇生物合成的代谢调控和构建高产紫杉醇基因工程菌株提供了强有力的理论指导。

紫杉二烯合成酶

紫杉二烯合成酶是第一个被详细研究和目前所发现的最重要的紫杉醇合成代谢酶,它催化紫杉醇生物合成途径中的第一个定向的、慢速的步骤,然而该步骤并非限速步骤。文章综述了紫杉二烯合成酶的酶学特性、催化机理、cDNA克隆和表达,以及对紫杉醇合成代谢通量的影响等方面的研究进展,指出紫杉醇生物合成途径中的限速步骤位于距环化步骤较远的下游处。

紫杉二烯合成酶基因转化红豆杉内生真菌XT5的研究

[目的]研究紫杉二烯合成酶基因转化短叶红豆杉(Taxus brevifolia)内生真菌XT5的情况。[方法]采用土壤农杆菌介导法将来自红豆杉中的紫杉二烯合成酶基因转入红豆杉内生真菌XT5中,研究紫杉醇发酵产量。[结果]成功转化得到8株重组子,其中XT5-TS-2的紫杉醇含量得到了大幅提高,其最高产量为423.983 4μg/L,比原始菌株提高了53.19%,表明转化紫杉二烯合成酶基因能够有效提高紫杉醇产量。[结论]该研究可为提高红豆杉内生真菌发酵生产紫杉醇产量提供理论支持。

南方红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA的克隆

目的采取分子手段通过紫杉醇生物合成途径对细胞中的紫杉醇产量进行调控。方法根据已发表的中国红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA序列设计2对引物,从南方红豆杉愈伤组织提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出该酶5’端长度为1 201 bp和3’端长度为1 388 bp的2个cDNA片段,将其克隆到pGEM-T Vector上并转化到E.coli DH5α中,5’端片段经XbaⅠ和BglⅡ双酶切鉴定,3’端片段经BglⅡ和SacⅠ双酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定,证实确为紫杉二烯合成酶基因。将这2个cDNA片段与双元载体pCAMBI-A1300连接并转化到E.coli DH5α中,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定。结果成功得到全长为2 589 bp的紫杉二烯合成酶基因,编码862个aa。结论南方红豆杉紫杉二烯合成酶基因与中国红豆杉紫杉二烯合成酶基因具有98%的同源性;并且紫杉二烯合成酶cDNA成功插入到pCAMBIA1300中,为下一步的转基因工作做好了准备。

诱导型和组成型启动子对酿酒酵母合成紫杉二烯的影响

近年来利用合成生物学手段生产萜类化合物逐渐成为一种趋势。诱导型和组成型启动子调控萜类的生产各有利弊,而启动子类型的选择需要根据特定体系和产物来进行具体分析。本工作针对紫杉醇关键前体紫杉二烯的合成,分别研究了酵母细胞中诱导型启动子和组成型启动子的调控。首先通过过表达酵母内源截短的羟甲戊二酰辅酶A基因(thmgr)和法尼基焦磷酸合酶基因(erg20),实现了对酵母内源模块的调控。随后向改造后的底盘细胞中整合入诱导性启动子调控的外源紫杉二烯合成模块,得到了紫杉二烯产量为5.2mg·L-1的人工酵母。而换用组成型启动子tdh3p调控时,产量达到11.5mg·L-1,说明对于这个体系组成型启动子更为适合。通过简单的发酵条件优化,该菌株产量提升了70%,达到19.5mg·L-1。组成型启动子调控的菌株可以利用葡萄糖作为碳源,因而更利于后续大规模发酵。

紫杉二烯生物合成模块与不同底盘的适配

以酿酒酵母BY4742及其单敲菌株作为底盘细胞,优化底盘细胞甲羟戊酸途径,上调并融合表达牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)合成的相关基因,引入人工合成的外源GGPP合成酶基因与紫杉二烯合成酶基因,构建了多载体紫杉二烯生物合成模块;还利用酵母组装技术,通过对紫杉二烯合成路径相关基因进行模块化设计组装,构建了依托单一着丝粒(CEN)质粒的紫杉二烯生物合成模块.将构建的2个模块与不同底盘细胞进行适配,使紫杉二烯产量获得了数倍提升,最高产量可达74.84 mg/L.

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶基因在灰盖鬼伞中的组合表达

紫杉二烯是紫杉醇合成途径中的前体物质。紫杉醇是红豆杉的一种重要的次级代谢产物,是一种重要的新型抗癌药物。然而,紫杉醇在植物中含量低且难提取,限制了高效应用。利用基因工程手段,借助担子菌类真菌灰盖鬼伞具有的内源类异戊二烯合成途径,构建含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate,GGPP)合酶和紫杉二烯合酶的融合基因表达载体p Bg GGTS和独立表达盒表达载体p Bg GGg TS,并分别转入灰盖鬼伞LT2菌株中,经过选择性筛选、PCR鉴定、Southern blotting杂交验证,分别获得了5株融合表达的灰盖鬼伞工程菌和5株独立表达盒的灰盖鬼伞工程菌株。各随机挑选了1株工程菌株,分别提取菌丝体和发酵液分析。GC-MS分析表明,两种工程菌株与原出发菌株的菌丝提取物无明显差异峰,而与出发菌株的发酵液提取物相比,两种转基因灰盖鬼伞的发酵液中均出现了明显的差异峰,采用GC-MS特征质量离子分析方法判定为紫杉二烯,分别为44 ng/L(转化p Bg GGg TS)和30 ng/L(转化p Bg GGTS)。结果表明,通过在灰盖鬼伞融合基因或各自独立表达的形式共表达ggpps和ts基因,可以生物合成紫杉二烯。

紫杉二烯人工酵母的代谢组学分析

为了更深入地从代谢角度研究萜类合成人工酵母的内在差异,以紫杉二烯人工酵母为例,利用代谢组学的方法对其发酵指数中期胞内代谢物的变化进行了测定。结果表明,与对照菌W303-1A相比,紫杉二烯的生产会对胞内糖酵解、三羧酸循环中间物及一些氨基酸的含量产生不同程度的影响,进而对其生长产生一定抑制作用。其中柠檬酸因紫杉二烯功能模块的引入下降明显,降幅达90%以上,因此可以作为后续功能酵母研究的标志性代谢物。紫杉二烯人工酵母细胞代谢组的研究可以为萜类化合物异源合成的优化提供更多的信息和帮助。

紫杉醇生物合成:由红豆杉悬浮培养细胞中细胞色素P_(450)羟化酶催化的紫杉二烯-5α-醇及其乙酸酯的差别转化

研究表明,紫杉二烯-5α-醇的酰化反应可能是紫杉醇生物合成的第三步反应,为了明确紫杉二烯醇或其对应的乙酸酯是否在随后的氧化反应中作为直接前体,本次分别以紫杉二烯-5α-醇及其乙酸酯为底物,由细胞色素P_(450)酶微粒体制剂催化。

穗花杉中不存在紫杉醇的化学及分子生物学证据

穗花杉(Amentotaxus argotaenia(Hance)Pilger)是红豆杉科穗花杉属的一个种。由于穗花杉与红豆杉属植物具有较近的亲缘关系,有研究者认为穗花杉也可以合成紫杉醇,并利用HPLC法测到其含有紫杉醇。但这仅仅是依靠HPLC中出峰时间来判断,并没有质谱结果。该研究利用LC-MS对穗花杉茎叶的化学提取物分析结果显示,穗花杉的茎叶中均未发现紫杉醇。为了进一步证明穗花杉不能合成紫杉醇,该研究利用欧洲红豆杉(Taxus baccata L.)紫杉醇生物合成关键基因-紫杉二烯合成酶基因(Taxadiene synthase gene,TbTS)的序列TBLASTN比对穗花杉本地转录组,从中找出并克隆得到与TbTS同源性最高的AarTSL1基因;利用原核表达分析AarTSL1基因的编码蛋白,结果发现该基因不具有紫杉二烯合成酶编码基因的功能。该研究从化学和生物学两个方面均证明穗花杉无法合成紫杉醇,为以后通过植物学和化学分类学等研究穗花杉的分类学地位提供了新的有用信息。

紫杉醇生物合成酶的研究进展

抗癌药紫杉醇是具有萜类环状结构的天然次生代谢产物.研究紫杉醇生物合成酶,特别是其合成关键酶,将为利用基因工程手段大量生产紫杉醇打下基础.对紫杉醇生物合成过程中参与酶的研究进展作一综述.

增强大肠杆菌MEP2通路发酵生产抗癌药物紫杉醇前体

用合成生物学的方法构建模块,使大肠杆菌遗传背景发生改变,生产红豆杉次生代谢产物紫杉醇前体物质——4(5),11(12)紫杉二烯(Taxadiene)。首先,用基因工程操作手段构建MEP2(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate,2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径)模块,这个模块包括4个基因:ispC、ispE、ispH和ispG,4个基因的表达产物属于大肠杆菌固有途径中的几个酶蛋白;模块构建好后,通过电穿孔的方式把MEP2转化到已含有上游MEP1模块和下游TG模块的大肠杆菌中,改变大肠杆菌固有的遗传信息。再用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导所转入基因的表达,最后用气相色谱-质谱(GC-MS)方法检测表达情况。成功构建MEP2模块;通过与MEP1模块和TG模块的组合实验,MEP2模块能加强菌株表达紫杉二烯。结果表明,微生物大肠杆菌可以通过基因工程改造手段来生产植物天然药物紫杉醇前体物质4(5),11(12)紫杉二烯以及其他中间体。

合成生物学在医药领域的应用

随着自然科学的发展,催生了21世纪工程学和生物科学交叉领域的合成生物学。当前,合成生物学广泛应用于环境、可再生能源、人体健康及药物领域,由方兴未艾快步走向飞速发展阶段。本文将在介绍合成生物学发展进程的基础上,着重就其在青蒿二烯、紫杉二烯2种合成药物上的应用进行讨论,并对合成生物学的发展前景进行展望。

香榧中不存在紫杉醇的化学及分子生物学证据

香榧(Torreya grandis Fort.ex Lindl.cv.Merrillii)是红豆杉科榧树属的一个种。由于香榧与红豆杉属植物具有较近的亲缘关系,研究者认为香榧也可以合成紫杉醇,并利用HPLC法验证其中含有紫杉醇。但他们仅仅依靠HPLC中出峰时间来判断,并没有质谱的分析结果。本研究利用LC-MS对香榧茎叶的化学提取物进行分析发现香榧并不能合成紫杉醇。为了进一步证明香榧不能合成紫杉醇,我们利用欧洲红豆杉(Taxus baccata L.)紫杉醇生物合成关键基因-紫杉二烯合成酶基因(Taxadiene synthase gene,Tb TS)TBLASTN比对香榧本地转录组,从中找出并克隆得到与Tb TS同源性最高的Tgr TSL1基因。利用原核表达对Tgr TSL1基因进行功能分析,发现该基因不具有紫杉二烯合成酶编码基因的功能。这样,我们从化学和生物学两个方面对香榧无法合成紫杉醇这个结论进行了证明。这为以后通过植物学和化学分类学等研究穗花杉的分类学地位提供了新的有用信息。

紫杉醇在酵母中的组合生物合成

紫杉醇是萜类的一种重要的次级代谢产物,是一种重要的新型抗癌药物。但由于资源紧缺、产率低等问题使得紫杉醇的价格昂贵,阻碍了紫杉醇的进一步应用。利用微生物进行组合生物合成生产紫杉醇将是一种新型的生产方式。酵母是目前用于组合生物合成研究最多和最有应用前景的宿主。文章对近年来利用酵母进行紫杉醇的组合生物合成的研究进展进行了总结,分析了目前存在的问题,并提出了将来可能的研究重点和发展方向,为研究工作者提供思路和借鉴。

生物合成紫杉醇的研究进展

紫杉醇是红豆杉及其内生真菌产生的萜类次级代谢产物,作为有效的抗癌药物,目前生产主要依赖于红豆杉,供求矛盾十分突出。为解决紫杉醇来源匮乏的问题,开展了多项代替红豆杉的研究。本文总结近年红豆杉细胞培养和微生物组合生物合成方面的研究进展,供生物合成紫杉醇的进一步研究参考。