东北红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA克隆及其与紫杉醇产生菌基因组DNA的Southern杂交(英文)

为进一步研究紫杉二烯合成酶的作用机理和紫杉醇生物合成代谢调控机制,采用RT-PCR技术从东北红豆杉(Taxus cuspidata)树叶中获得了紫杉二烯合成酶基因片段,将该片段克隆在载体pGEMT-easy vector上,并转化到E.coliJM109中,经EcoRI酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定,获得紫杉二烯合成酶基因片段长度为909 bp,编码303个氨基酸,与GenBank中收录的紫杉二烯合成酶的同源性达到98%;对获得的紫杉二烯合成酶基因和紫杉醇产生菌HQD33基因组DNA进行了Southern杂交。结果初步证实了紫杉二烯合成酶存在于通过内生真菌发酵生产紫杉醇的生物合成途径中。为利用分子生物学手段研究通过内生真菌发酵生产紫杉醇生物合成的代谢调控和构建高产紫杉醇基因工程菌株提供了强有力的理论指导。

紫杉二烯合成酶

紫杉二烯合成酶是第一个被详细研究和目前所发现的最重要的紫杉醇合成代谢酶,它催化紫杉醇生物合成途径中的第一个定向的、慢速的步骤,然而该步骤并非限速步骤。文章综述了紫杉二烯合成酶的酶学特性、催化机理、cDNA克隆和表达,以及对紫杉醇合成代谢通量的影响等方面的研究进展,指出紫杉醇生物合成途径中的限速步骤位于距环化步骤较远的下游处。

紫杉二烯合成酶基因转化红豆杉内生真菌XT5的研究

[目的]研究紫杉二烯合成酶基因转化短叶红豆杉(Taxus brevifolia)内生真菌XT5的情况。[方法]采用土壤农杆菌介导法将来自红豆杉中的紫杉二烯合成酶基因转入红豆杉内生真菌XT5中,研究紫杉醇发酵产量。[结果]成功转化得到8株重组子,其中XT5-TS-2的紫杉醇含量得到了大幅提高,其最高产量为423.983 4μg/L,比原始菌株提高了53.19%,表明转化紫杉二烯合成酶基因能够有效提高紫杉醇产量。[结论]该研究可为提高红豆杉内生真菌发酵生产紫杉醇产量提供理论支持。

南方红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA的克隆

目的采取分子手段通过紫杉醇生物合成途径对细胞中的紫杉醇产量进行调控。方法根据已发表的中国红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA序列设计2对引物,从南方红豆杉愈伤组织提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出该酶5’端长度为1 201 bp和3’端长度为1 388 bp的2个cDNA片段,将其克隆到pGEM-T Vector上并转化到E.coli DH5α中,5’端片段经XbaⅠ和BglⅡ双酶切鉴定,3’端片段经BglⅡ和SacⅠ双酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定,证实确为紫杉二烯合成酶基因。将这2个cDNA片段与双元载体pCAMBI-A1300连接并转化到E.coli DH5α中,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定。结果成功得到全长为2 589 bp的紫杉二烯合成酶基因,编码862个aa。结论南方红豆杉紫杉二烯合成酶基因与中国红豆杉紫杉二烯合成酶基因具有98%的同源性;并且紫杉二烯合成酶cDNA成功插入到pCAMBIA1300中,为下一步的转基因工作做好了准备。

紫杉醇生物合成酶的研究进展

抗癌药紫杉醇是具有萜类环状结构的天然次生代谢产物.研究紫杉醇生物合成酶,特别是其合成关键酶,将为利用基因工程手段大量生产紫杉醇打下基础.对紫杉醇生物合成过程中参与酶的研究进展作一综述.

穗花杉中不存在紫杉醇的化学及分子生物学证据

穗花杉(Amentotaxus argotaenia(Hance)Pilger)是红豆杉科穗花杉属的一个种。由于穗花杉与红豆杉属植物具有较近的亲缘关系,有研究者认为穗花杉也可以合成紫杉醇,并利用HPLC法测到其含有紫杉醇。但这仅仅是依靠HPLC中出峰时间来判断,并没有质谱结果。该研究利用LC-MS对穗花杉茎叶的化学提取物分析结果显示,穗花杉的茎叶中均未发现紫杉醇。为了进一步证明穗花杉不能合成紫杉醇,该研究利用欧洲红豆杉(Taxus baccata L.)紫杉醇生物合成关键基因-紫杉二烯合成酶基因(Taxadiene synthase gene,TbTS)的序列TBLASTN比对穗花杉本地转录组,从中找出并克隆得到与TbTS同源性最高的AarTSL1基因;利用原核表达分析AarTSL1基因的编码蛋白,结果发现该基因不具有紫杉二烯合成酶编码基因的功能。该研究从化学和生物学两个方面均证明穗花杉无法合成紫杉醇,为以后通过植物学和化学分类学等研究穗花杉的分类学地位提供了新的有用信息。

香榧中不存在紫杉醇的化学及分子生物学证据

香榧(Torreya grandis Fort.ex Lindl.cv.Merrillii)是红豆杉科榧树属的一个种。由于香榧与红豆杉属植物具有较近的亲缘关系,研究者认为香榧也可以合成紫杉醇,并利用HPLC法验证其中含有紫杉醇。但他们仅仅依靠HPLC中出峰时间来判断,并没有质谱的分析结果。本研究利用LC-MS对香榧茎叶的化学提取物进行分析发现香榧并不能合成紫杉醇。为了进一步证明香榧不能合成紫杉醇,我们利用欧洲红豆杉(Taxus baccata L.)紫杉醇生物合成关键基因-紫杉二烯合成酶基因(Taxadiene synthase gene,Tb TS)TBLASTN比对香榧本地转录组,从中找出并克隆得到与Tb TS同源性最高的Tgr TSL1基因。利用原核表达对Tgr TSL1基因进行功能分析,发现该基因不具有紫杉二烯合成酶编码基因的功能。这样,我们从化学和生物学两个方面对香榧无法合成紫杉醇这个结论进行了证明。这为以后通过植物学和化学分类学等研究穗花杉的分类学地位提供了新的有用信息。