中国红豆杉紫杉烷10β-羟化酶的分子克隆及在酿酒酵母中的表达

天然产物紫杉醇是一种重要的抗癌药。其天然来源的匮乏和缺少商业上可行的化学全合成促进了对紫杉醇生物来源的深入研究。紫杉醇的生物合成是一个复杂的多步过程,主要包括四环骨架的构建和加入各种羟基和酰基基团,其中羟基的加入由细胞色素P450氧化酶催化。我们从中国红豆杉愈伤组织细胞mRNA构建的cDNA文库中克隆得到几个P450 cDNA片段。其中一个长1 494 bp的cDNA片段,编码497个氨基酸,推断蛋白分子量为56470 Da,等电点为9.42。序列比较显示,这个推断蛋白包含多个细胞色素P450氧化酶的保守区,具有典型的细胞色素P450氧化酶的特征,进一步的比较发现其与已鉴定的东北红豆杉紫杉烷-10 β-羟化酶有92%的同源性。将这个cDNA片段连接在质粒pYeDP60上构建表达载体,导入相应的酵母表达菌株WHT和WVS进行表达,获得相应大小的蛋白表达条带,功能鉴定的工作正在进行中。

南方红豆杉紫杉烷13α-羟化酶基因的克隆及序列分析

目的:紫杉烷13α-羟化酶是紫杉醇下游合成途径关键酶之一,负责催化紫杉二烯-5α-醇的C13侧链发生羟基化反应生成紫杉二烯-5α、13α-二醇。该研究从南方红豆杉中克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因并对其序列进行生物信息学分析。方法:利用南方红豆杉的总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因的DNA序列和cDNA序列,利用swiss-prot、DNAMAN等生物信息学工具对其核酸序列和蛋白序列进行分析。结果:测序结果显示其cDNA序列长度为1 651bp,含有一个1 458bp的开放阅读框,同源性比较分析结果表明,其氨基酸序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的紫杉烷13α-羟化酶氨基酸序列的一致性为96%。结论:成功克隆出南方红豆杉紫杉烷13α-羟化酶基因,为利用合成生物学工程技术生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础。

紫杉烷-2α-羟化酶基因的克隆及分析

本试验成功克隆到了紫杉烷-2α-羟化酶基因,并将该基因与载体pEASY-T1连接,转化到E.coli DH5α中,并对阳性克隆子进行了测序及生物信息学分析。试验结果表明,紫杉烷-2α-羟化酶基因长度为1 488 bp,与GenBank中收录的紫杉烷-2α-羟化酶基因同源性达到99%。本试验研究为从N.sylviforme内生真菌紫杉醇生物合成途径中克隆关键酶基因提供了借鉴。

工业色谱法分离制备7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇酶解产物10-去乙酰紫杉醇

基于工业色谱法分离制备抗癌药物紫杉醇的半合成前体10-去乙酰紫杉醇(10-DAP)。7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇(10-DAXP)在我国特有红豆杉品系(中华红豆杉)枝叶中含量丰富,以其为原料可制备紫杉醇最理想的半合成前体——10-DAP。本研究以部分纯化后的7-木糖基-10-去乙酰紫杉烷为原料,通过β-木糖苷酶水解该粗提物中的主要成分10-DAXP及其两个微量类似物7-木糖基-10-去乙酰三尖杉宁碱(10-DAXC)和7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇C(10-DAXP C),脱去其C-7位上的木糖基,水解产物采用大孔吸附树脂吸附,正相快速柱分离和反相制备色谱分离,可获得高纯度的目标物10-DAP,产物纯度为96%,整个工艺的收率大于75%。该方法适合以10-DAXP为原料大规模制备紫杉醇的半合成前体化合物10-DAP,为工业化生产紫杉醇开辟了一条新途径。

美洲大蠊肠道产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株的筛选及鉴定

旨在筛选美洲大蠊肠道具有产7-木糖紫杉烷糖基水解酶性能的内生菌,并对其进行生物学鉴定。以实验室保存的178株美洲大蠊肠道内生菌为研究对象,采用刚果红透明圈法和荧光显色法筛选产木聚糖酶菌株,进一步利用薄层色谱法筛选产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株。在此基础上,选取一株高产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定,并采用高效液相色谱法测定其对7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的转化率。结果显示,178株美洲大蠊肠道内生菌中有55株菌产木聚糖酶,其中8株链霉菌和2株贪铜菌可产生7-木糖紫杉烷糖基水解酶。高产菌株WA11-2-9经形态学特征、生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定为Streptomyces enissocaesilis。WA11-2-9可将7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇转化为10-去乙酰巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰紫杉醇,主要产物10-去乙酰紫杉醇的转化率为21.52%。美洲大蠊肠道内生菌WA 11-2-9(GenBank Accession:MZ411692)具有分泌7-木糖紫杉烷糖基水解酶的能力,它为后续生物转化制备紫杉醇奠定了坚实基础。

中国红豆杉中多种紫杉烷同时检测的液质联用方法的建立

目的:建立能同时检测中国红豆杉中微量紫杉醇、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)、巴卡亭Ⅲ(B-Ⅲ)、巴卡亭Ⅵ(B-Ⅵ)和1-乙酰-5,7,10-去乙酰巴卡亭Ⅰ(DAB-Ⅰ)等多种紫杉烷的方法,了解该植物中重要紫杉烷的分布和代谢特征。方法:采用电喷雾质谱(ESI-MS)和多级离子阱技术摸索紫杉烷的加合离子峰和碎裂离子出现规律,利用反相高效液相色谱法同时测定植物样品中5种紫杉烷的含量。植物样品用液氮快速研磨,甲醇浸提,固相萃取方法制样。色谱柱为 HypersilODS C_(18)(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-甲醇-水(32:20:48),等度洗脱,流速为1mL·min^(-1),检测波长为227nm。结果:具有多个乙酰取代基的紫杉烷在 ESI-MS 正离子扫描时,产生强的铵加合离子峰,含羟基的紫杉烷易产生质子加合峰。最低检测限为0.5～1.5mg·L^(-1),紫杉醇在2.0～180mg·L^(-1)(r=0.9993),10-DAB 在2.0～166.0mg·L^(-1)(r=0.9975),B-Ⅲ在6～170mg·L^(-1)(r=0.9937),B-Ⅵ在7.0～200.0mg·L^(-1)(r=0.9921),DAB-Ⅰ在1.0～130mg·L^(-1)(r=0.9945)范围内具有良好的线性关系。紫杉醇回收率为98%±1.5%,日内 RSD 为1.8%,日间 RSD 为2.5%。结论:应用该方法测定了中国红豆杉不同组织中相应紫杉烷的含量,得到了良好的结果。

人工栽培南方红豆杉紫杉烷成分的研究

采用溶剂萃取及多种色谱技术分离纯化,从人工栽培南方红豆杉中分离得到紫杉醇(Ⅰ)、2′-乙酰氧基-7-表-紫杉醇(Ⅱ)、(3E,7E)-2,α10,β13α-三乙酰基-5,α20-二羟基-3,8-断紫杉烷-3,7,11-三烯-9-酮(Ⅲ)和7-表-紫杉醇(Ⅳ),其中化合物(Ⅱ)首次从南方红豆杉分离得到。

海南粗榧紫杉烷13α-羟化酶基因的克隆及实时定量表达分析

本研究利用RACE技术从海南粗榧（Cephalataxus mannii）中克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因。该基因含有一个1 488 bp长的开放阅读框（ORF）,可编码495个氨基酸,该序列所编码氨基酸属于P450蛋白超家族系统,存在明显的疏水峰,含有线粒体靶向肽。进化树分析显示,该基因所编码的蛋白与紫杉醇合成途径中6种酰基转移酶来自同一个祖先,其中与紫杉烷13α-羟基化酶基因同源性最高,属于同一进化分支。实时荧光定量表达分析表明,紫杉烷13α-羟化酶基因在被茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后的海南粗榧中表达量变化显著,处理后0~12 h目的基因表达量变化不明显,12~24 h目的基因表达量剧增,达到最大值,形成明显波峰。结果表明紫杉醇的合成可能与植物体抵御逆境胁迫存在重要关联。

紫杉醇的生物合成:紫杉烷13α-羟化酶是依赖细胞色素P_(450)的单加氧酶

对诱导的红豆杉细胞进行差异显示,获得了一个细胞色素P_(450)基因家族,其中一个在酵母中表达,被认为是紫杉烷10β-羟化酶(taxane 10β-hydroxylase)。对在酵母中不能表达的克隆,采用秋粘虫-杆状病毒体系进行异源表达,试图获得这些克隆的基因功能。 方法和材料:用带有细胞色素P_(450)

不同产地及生长年限曼地亚红豆杉中10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇量的比较分析

目的分析和比较5个不同产地、不同生长年限曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类活性成分量的差异。方法利用甲醇和三氯甲烷混合液超声浸提后再用甲醇溶解得到样品溶液;通过高效液相色谱法测定和比较10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB Ⅲ)、三尖杉宁碱和紫杉醇量及3者总量。结果不同产地、不同生长年限的曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类及其总量间存在极显著性差异(P<0.01);10-DAB Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇和3种紫杉烷类总量相对较高的3个产地及生长年限分别依次为HK4>SM3>SM2、ZL3>HK4>ZL4、ZL3>SM2>HK4、HK4>ZL3>ZL6。除10-DAB Ⅲ与三尖杉宁碱量间不存在显著的相关性外,其余各成分间均存在极显著的正相关关系(P<0.01);不同产地及生长年限间紫杉醇与3种紫杉烷类总量间呈现出同升同降的趋势;聚类分析表明福建福州产区紫杉醇量具有一定的特殊性,而河南开封3种紫杉烷类总量有别于其他产区。结论产地和生长年限对曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类量的变化具有明显的影响,可以通过对生物合成途径进行调控,继而达到获得更多紫杉醇原料药的目的。

曼地亚红豆杉枝叶化学成分研究

目的研究曼地亚红豆杉Taxus media枝叶的化学成分。方法通过硅胶、凝胶Sephadex LH-20、ODS等色谱方法分离纯化,运用~1H-NMR、^(13)C-NMR、ESI-MS等多种波谱技术鉴定化合物结构。结果从曼地亚红豆杉乙醇提取物的石油醚、醋酸乙酯萃取部位分离鉴定出18个化合物,包括8个紫杉烷二萜类化合物:taxinine-11,12-oxide(1)、9α,10β-二乙酰基-2α-羟基-5α-桂皮酰基-3,11-环化紫杉烷-4(20)-烯-13-酮(2)、2-去乙酰氧基紫杉宁E(3)、7,9-二去乙酰基紫杉宁B(4)、紫杉吉酚(5)、9-去乙酰基紫杉宁A(6)、9-去乙酰基紫杉宁(7)、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(8);5个黄酮类化合物:山柰酚(9)、香橙素(10)、芹菜素(11)、金松双黄酮(12)、银杏双黄酮(13);3个酚酸类化合物:对羟基苯甲醛(14)、对羟基苯甲酸(15)、邻苯二酚(16);以及β-谷甾醇(17)、正二十烷-10-醇(18)。结论化合物18为首次从红豆杉科植物中发现,化合物1~4、6、7、10、14~16为首次从曼地亚红豆杉中分离得到。