南方红豆杉紫杉烷13α-羟化酶基因的克隆及序列分析

目的:紫杉烷13α-羟化酶是紫杉醇下游合成途径关键酶之一,负责催化紫杉二烯-5α-醇的C13侧链发生羟基化反应生成紫杉二烯-5α、13α-二醇。该研究从南方红豆杉中克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因并对其序列进行生物信息学分析。方法:利用南方红豆杉的总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因的DNA序列和cDNA序列,利用swiss-prot、DNAMAN等生物信息学工具对其核酸序列和蛋白序列进行分析。结果:测序结果显示其cDNA序列长度为1 651bp,含有一个1 458bp的开放阅读框,同源性比较分析结果表明,其氨基酸序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的紫杉烷13α-羟化酶氨基酸序列的一致性为96%。结论:成功克隆出南方红豆杉紫杉烷13α-羟化酶基因,为利用合成生物学工程技术生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础。

海南粗榧紫杉烷13α-羟化酶基因的克隆及实时定量表达分析

本研究利用RACE技术从海南粗榧（Cephalataxus mannii）中克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因。该基因含有一个1 488 bp长的开放阅读框（ORF）,可编码495个氨基酸,该序列所编码氨基酸属于P450蛋白超家族系统,存在明显的疏水峰,含有线粒体靶向肽。进化树分析显示,该基因所编码的蛋白与紫杉醇合成途径中6种酰基转移酶来自同一个祖先,其中与紫杉烷13α-羟基化酶基因同源性最高,属于同一进化分支。实时荧光定量表达分析表明,紫杉烷13α-羟化酶基因在被茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后的海南粗榧中表达量变化显著,处理后0~12 h目的基因表达量变化不明显,12~24 h目的基因表达量剧增,达到最大值,形成明显波峰。结果表明紫杉醇的合成可能与植物体抵御逆境胁迫存在重要关联。

紫杉烷-2α-羟化酶基因的克隆及分析

本试验成功克隆到了紫杉烷-2α-羟化酶基因,并将该基因与载体pEASY-T1连接,转化到E.coli DH5α中,并对阳性克隆子进行了测序及生物信息学分析。试验结果表明,紫杉烷-2α-羟化酶基因长度为1 488 bp,与GenBank中收录的紫杉烷-2α-羟化酶基因同源性达到99%。本试验研究为从N.sylviforme内生真菌紫杉醇生物合成途径中克隆关键酶基因提供了借鉴。

紫杉烷13α-羟基化酶基因的克隆及其转化烟草的研究

利用东北红豆杉(Taxus cuspidata)cDNA文库作为模版,通过PCR技术扩增得到我国东北红豆杉紫杉烷13α-羟基化酶(Taxane13α-hydroxylase,简称13OH)的全长cDNA,将PCR产物克隆到pGM-T载体后测序结果表明该序列长度为1458bp。同源性比较分析结果表明:其碱基序列与已经报道的东北红豆杉(Taxus cuspidata)的13OH基因的一致性为99.38%,其氨基酸序列同与已经报道的东北红豆杉的13OH氨基酸序列的一致性为99.18%。将获得的cDNA全长序列正向插入到含有GUS报告基因的pCambia1305.1后成功地构建出东北红豆杉13OH植物表达载体pC13OH,通过电击法把pC13OH转入根癌农杆菌GV3101中。利用该工程菌株对普通烟草进行了转化,在潮霉素选择压力下获得了完整的再生植株。利用13OH基因特异引物,通过PCR技术筛选到4株阳性再生植株。在这4株再生植株中,有3株植株GUS报告基因的组织化学染色呈现阳性反应,表明该植物载体表达载体中与13OH相融合的GUS基因成功地得到了表达。为今后深入研究13OH基因在烟草中的表达和开展紫杉烷13α-羟基化酶基因对红豆杉细胞的转化以及研究作用于该基因的小RNA调节子打下了基础。

中国红豆杉紫杉烷10β-羟化酶的分子克隆及在酿酒酵母中的表达

天然产物紫杉醇是一种重要的抗癌药。其天然来源的匮乏和缺少商业上可行的化学全合成促进了对紫杉醇生物来源的深入研究。紫杉醇的生物合成是一个复杂的多步过程,主要包括四环骨架的构建和加入各种羟基和酰基基团,其中羟基的加入由细胞色素P450氧化酶催化。我们从中国红豆杉愈伤组织细胞mRNA构建的cDNA文库中克隆得到几个P450 cDNA片段。其中一个长1 494 bp的cDNA片段,编码497个氨基酸,推断蛋白分子量为56470 Da,等电点为9.42。序列比较显示,这个推断蛋白包含多个细胞色素P450氧化酶的保守区,具有典型的细胞色素P450氧化酶的特征,进一步的比较发现其与已鉴定的东北红豆杉紫杉烷-10 β-羟化酶有92%的同源性。将这个cDNA片段连接在质粒pYeDP60上构建表达载体,导入相应的酵母表达菌株WHT和WVS进行表达,获得相应大小的蛋白表达条带,功能鉴定的工作正在进行中。

外显子拼接法克隆紫杉烷2α-羟基化酶基因与生物信息学分析

紫杉烷2α-羟基化酶是形成紫杉醇核心骨架的羟基化反应关键酶之一,以taxusin作为底物进行氧化生成2α,7β-dihydroxytaxusin。利用蔓地亚红豆杉的总DNA为模板,采用PCR技术克隆出紫杉烷2α-羟基化酶的DNA序列,利用在线比对和生物学软件分析其内含子,采用外显子拼接法克隆出紫杉烷2α-羟基化酶基因的cDNA序列。测序结果表明该基因含有1个1 488 bp的开放阅读框,编码495个氨基酸的多肽;同源性比较分析结果表明,其碱基序列及氨基酸序列与已经报道的加拿大红豆杉的紫杉烷2α-羟基化酶基因的一致性为分别为98%和89%。利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其列进行了序列分析,为利用代谢工程的方法生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础。

南方红豆杉紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列的克隆和进化分析

从南方红豆杉Taxus wallichianavar.mairei的新鲜嫩叶中提取基因组DNA作为模板,利用三组特异引物进行PCR扩增,然后克隆测序得到紫杉烷7β-羟基化酶的基因全长。该基因编码区起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,全长1 692 bp;碱基组成为490 A(29.0%),351 C(20.7%),362 G(21.4%)和489 T(28.9%)。将紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列与细胞色素P450基因家族的其它三个成员进行比对,发现它与紫杉烷2α-羟基化酶基因、紫杉烷10β-羟基化酶基因及紫杉烷13α-羟基化酶基因的一致性分别为74%、68%及76%。它们的外显子和内含子的连接区均具保守的GT-AG结构,内含子区的变异性明显高于外显子区。进一步以红豆杉属的13个紫杉烷羟基化酶基因家族成员为对象,利用位点间可变ω(非同义替换率dN和同义替换率dS的比值)模型对该基因家族的适应性进化进行分析。分支模型、位点模型以及分支-位点模型的分析表明:紫杉烷羟基化酶基因家族的少数分支处于正选择压力下(ω>1),但未检测到正选择位点;而绝大部分位点受强烈的负选择作用(ω<1)。

人工栽培南方红豆杉紫杉烷成分的研究

采用溶剂萃取及多种色谱技术分离纯化,从人工栽培南方红豆杉中分离得到紫杉醇(Ⅰ)、2′-乙酰氧基-7-表-紫杉醇(Ⅱ)、(3E,7E)-2,α10,β13α-三乙酰基-5,α20-二羟基-3,8-断紫杉烷-3,7,11-三烯-9-酮(Ⅲ)和7-表-紫杉醇(Ⅳ),其中化合物(Ⅱ)首次从南方红豆杉分离得到。

紫杉醇的生物合成:紫杉烷13α-羟化酶是依赖细胞色素P_(450)的单加氧酶

对诱导的红豆杉细胞进行差异显示,获得了一个细胞色素P_(450)基因家族,其中一个在酵母中表达,被认为是紫杉烷10β-羟化酶(taxane 10β-hydroxylase)。对在酵母中不能表达的克隆,采用秋粘虫-杆状病毒体系进行异源表达,试图获得这些克隆的基因功能。 方法和材料:用带有细胞色素P_(450)

利用RNAi抑制曼地亚红豆杉细胞紫杉烷14β-羟基化酶基因的表达

目的:利用RNA干扰技术抑制紫杉烷14β-羟基化酶(简称14OH)基因的表达。方法:以曼地亚红豆杉(Taxus×media)为材料,通过农杆菌介导的双元载体转化系统将针对14OH基因构建的RNA干扰载体导入该植物细胞中。应用PCR-Southern技术对转基因细胞进行了鉴定。另外,利用RT-PCR技术检测14OH基因mRNA表达水平,并采用HPLC技术对转基因细胞系中三种C-14氧取代的紫杉烷成分进行测定。结果:Southern检测证实转基因实验获得成功,RT-PCR结果表明转基因细胞系中14OH基因mRNA表达水平与对照组相比显著下降,HPLC分析显示C-14氧取代的紫杉烷含量也有明显降低。结论:该RNA干扰技术有效地抑制了曼地亚红豆杉细胞内14OH基因的表达,有望为提高紫杉醇的生物合成产量提供一条新途径。

1例21-羟化酶缺陷症伴高血压患者的临床及基因变异分析

1临床资料患者男,30岁,因发现血压升高3年,血压控制差1个月于2012年6月25日就诊于杭州市红十字会医院(我院)内分泌科。2009年9月23日体检发现血压升高(152/110 mm Hg, 1 mm Hg=0.133 kPa),当时无头痛头晕,无心悸、胸闷,无手抖、多汗,无肢软乏力等症状,在某省级附属医院心内科就诊,查血压170/108 mm Hg, 心率88次/min, 化验示血常规、甲状腺功能均正常。

热不对称交错PCR克隆bapt基因侧翼序列

紫杉醇是来源于红豆杉植物的抗癌药物,广泛应用于乳腺癌和小细胞肺癌等临床治疗。巴卡亭Ⅲ-氨基苯基丙酰-13-O-转移酶基因(bapt)的表达是紫杉醇合成的瓶颈,解析该基因侧翼序列是人工调控紫杉醇合成途径的前提。采用同源克隆和热不对称交错PCR技术,扩增获得bapt基因及其侧翼的染色体序列5.6 kb。生物信息学分析表明,bapt基因含有2个外显子和1个内含子,编码区长度1 338 bp;5’端侧冀序列1 604 bp,包含启动子元件;3’端2 582 bp,含有终止子元件242 bp。发现的转录元件将应用于代谢工程改造红豆杉细胞,提高紫杉醇产量。