miR-152-3p表达下调降低紫杉醇耐药人卵巢癌细胞A2780T对紫杉醇的耐药性

目的探讨miR-152-3p对紫杉醇耐药人卵巢癌细胞A2780T对紫杉醇耐药性的影响及机制。方法①紫杉醇(1.875,3.75,7.5,17和23μmol·L^(-1))与人卵巢癌A2780和A2780T细胞作用48 h,MTT法检测细胞存活率,计算抑制细胞存活半数抑制浓度(IC50)值和耐药指数(RI)。Western印迹法检测A2780和A2780T细胞耐药蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)蛋白表达。②实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测A2780和A2780T细胞miR-152-3p表达水平。脂质体瞬时转染技术转染miR-152-3p抑制物降低A2780T细胞中miR-152-3p表达(miR-152-3p抑制物组),同时设转染miR-152-3p阴性对照组,RT-qPCR检测转染效率,MTT法、划痕实验和流式细胞术分别检测转染miR-152-3p抑制物对A2780T细胞存活、迁移和凋亡的影响;Western印迹法检测转染miR-152-3p抑制物对A2780T细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。③用miRDB,Targetscan,miRWalk和Starbase数据库预测miR-152-3p的靶基因,并用Western印迹法检测转染miR-152-3p抑制物后A2780T细胞磷酸酯酶张力蛋白同源物(PTEN)蛋白表达的变化及RT-qPCR检测A2780和A2780T细胞PTEN mRNA表达水平予以验证。随后,脂质体瞬时转染技术转染PTEN siRNA沉默A2780T细胞中PTEN表达,同时设转染siRNA阴性对照组,RT-qPCR检测转染效率,MTT法检测沉默PTEN表达后A2780T细胞存活率和IC50值,Western印迹法检测P-gp,MRP1和ABCG2蛋白表达。结果①紫杉醇处理后A2780和A2780T细胞存活率均降低(P<0.01),A2780T细胞RI为2.8。与A2780细胞相比,A2780T细胞P-gp,MRP1和ABCG2蛋白高表达(P<0.05,P<0.01)。②与A2780细胞相比,A2780T细胞miR-152-3p明显高表达(P<0.01)。与转染miR-152-3p阴性对照组比较,转染miR-152-3p抑制物后A2780T细胞存活率(P<0.05,P<0.01)和细胞迁移能力(P<0.05)明显降低,细胞凋亡率升高(P<0.01);Bax蛋白表达增加(P<0.01),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。③生物信息学数据库分析结果提示,PTEN是miR-152-3p的一个靶基因;Western印迹法验证显示,转染miR-152-3p抑制物组A2780T细胞PTEN蛋白表达低于转染miR-152-3p阴性对照组(P<0.05);RT-qPCR结果显示,A2780T细胞PTEN mRNA表达水平高于A2780细胞(P<0.01)。转染PTEN siRNA沉默PTEN表达后,与转染siRNA阴性对照组相比,A2780T细胞存活率(P<0.05,P<0.01)和IC50值(P<0.01)显著降低,P-gp,MRP1和ABCG2蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论miR-152-3p在A2780T细胞中高表达,其表达下调可抑制A2780T细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡,降低A2780T细胞对紫杉醇的耐药性,该作用可能是通过降低其靶基因PTEN表达发挥的。

自噬抑制剂促进紫杉醇耐药卵巢癌细胞对化疗敏感性的研究

目的探讨自噬激活在紫杉醇(paclitaxel,PTX)耐药卵巢癌(ovarian cancer)细胞中的作用及自噬抑制对耐药细胞化疗的影响。方法以卵巢癌细胞系SKOV3和紫杉醇耐药卵巢癌细胞(SKOV3/PTX)为研究对象;利用MTT实验检测细胞活力变化;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡;免疫印迹(Western blot,WB)法检测蛋白表达变化;利用脂质体瞬时转染法使细胞表达LC3-GFP-RFP荧光蛋白;利用激光共聚焦显微镜检测细胞荧光蛋白定位及表达。结果相比SKOV3细胞,相同剂量的PTX对SKOV3/PTX细胞的活力抑制能力明显降低,紫杉醇对SKOV3细胞和SKOV3/PTX细胞的半数抑制浓度((inhibitory concentration 50%,IC50)分别为(41.91±2.92)μM和(114.6±17.6)μM。此外,在凋亡水平上,PTX对SKOV3/PTX细胞的诱导凋亡作用显著降低。通过LC3-GFP-RFP过表达和LC3、p62蛋白检测,证明SKOV3/PTX细胞的自噬激活程度增高。采用自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)和3-MA可以阻断细胞自噬,并提高PTX对SKOV3/PTX细胞的活力抑制能力和诱导凋亡作用。结论自噬激活在紫杉醇耐药的卵巢癌细胞中发挥了保护作用,抑制自噬可以增强紫杉醇对耐药细胞的杀伤作用。

miR-21转染对卵巢癌细胞株A2780/Taxol紫杉醇耐药性的影响及机制探讨

目的探讨microRNA-21(miR-21)在卵巢癌化疗耐药中的作用及机制。方法荧光定量RT-PCR法检测miR-21在人卵巢癌细胞株A2780及A2780/Taxol的表达水平,合成miR-21的干扰序列,以脂质体为载体转染A2780/Taxol细胞;MTT法检测细胞转染前后对紫杉醇的耐药性;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;蛋白质印迹法检测磷酸酶基因(PTEN)、BAX及Bcl-2蛋白。结果 miR-21表达下调后,A2780/Taxol对紫杉醇的IC50值明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显增加(P<0.05),细胞内PTEN、BAX蛋白表达水平增加,Bcl-2表达降低。结论 miR-21在人卵巢癌耐药株中呈高表达,其可能是介导人卵巢癌耐药的主要因素之一,具体机制可能是降低PTEN、BAX及升高Bcl-2来介导肿瘤细胞耐药。

卵巢癌多细胞球体对紫杉醇耐药及其机制的探讨

背景和目的:多细胞球体(multicellularspheroids,MCS)对传统细胞毒化疗药物的敏感性明显低于单层细胞。本实验旨在探讨卵巢癌MCS耐药的分子机制。方法:以单层细胞为对照,以三维培养方法获得的人卵巢癌A2780MSC和CAOV3MCS为模型,采用台盼蓝拒染法比较紫杉醇对单层细胞和MCS生长的抑制作用,流式细胞仪比较单层细胞和MCS细胞周期的分布和细胞凋亡率;采用流式细胞仪、蛋白质免疫印迹法、激光共聚焦显微镜检测单层细胞及MCS的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达及亚细胞分布;采用RT-PCR法检测mdr1mRNA表达水平。结果:(1)不同浓度的紫杉醇(0.2、2.0、10.0、20.0μmol/L)作用后,MCS细胞生长抑制率明显低于单层细胞(PA2780=0.003,PCAOV3=0.015);经20.0μmol/L的紫杉醇作用后,单层细胞的细胞凋亡率明显高于MCS,差异有统计学意义(PA2780=0.034,PCAOV3=0.032)。(2)流式细胞仪、蛋白质免疫印迹法、激光共聚焦显微镜检测提示P-gp在单层细胞中不表达,在MCS中表达明显升高(P均<0.05);RT-PCR证实MCS中有mdr1mRNA表达,而单层细胞中未检出其表达。(3)流式细胞仪检测提示将单层细胞培养成MCS时,G0/G1期细胞比率增加,S期和G2/M期细胞比率降低(P均<0.05)。结论:卵巢癌MCS对紫杉醇化疗耐药性增加,其高表达P-gp。

BKM120对紫杉醇耐药卵巢癌细胞的抑制作用

目的研究BKM120对卵巢癌A2780细胞和紫杉醇耐药卵巢癌A2780/Taxol细胞的抑制作用。方法采用MTT法检测A2780和A2780/Taxol细胞存活情况,设溶剂对照组和实验(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)组(BKM120浓度分别为0,0.1,0.3,1.0,3.0,10.0,30.0,100.0μmol/L)。PI单染检测细胞周期的分布情况;TUNEL荧光染色检测细胞凋亡情况,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白表达水平,设阳性对照组[顺铂(DDP)组,10μmol/L]、溶剂对照组和实验A,B,C,D组(BKM120浓度分别为0,0.3,1.0,3.0,10.0μmol/L)。结果与溶剂对照组比较,实验(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)组A2780和A2780/Taxol细胞增殖抑制率显著升高(P<0.01或P<0.05);BKM120对A2780和A2780/Taxol细胞半数抑制浓度分别为(2.25±0.13)μmol/L和(4.17±0.43)μmol/L。与溶剂对照组比较,实验C,D组G2期A2780和A2780/Taxol细胞显著增多(P<0.01或P<0.05);DDP组和实验A,B,C,D组A2780和A2780/Taxol凋亡细胞显著增多(P<0.01或P<0.05);实验C组、D组A2780和A2780/Taxol细胞Bcl-2、Pro-caspase 3、P-gp蛋白表达水平和PAkt/Akt显著降低(P<0.01或P<0.05)。结论BKM120可降低紫杉醇耐药卵巢癌A2780/Taxol细胞的存活率,其机制可能与抑制A2780和A2780/Taxol细胞的增殖,下调P-Akt及P-gp蛋白表达水平诱导细胞凋亡有关。

辛二酰苯胺异羟肟酸对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞OC3/P存活和凋亡的影响

目的 研究辛二酞苯胺异羟肟酸（SAHA）对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞OC3/P存活和凋亡的影响。方法 SAHA 4~64 μmol·L-1与OC3/P细胞作用6，12，24或48 h，用倒置显微镜观察细胞形态的变化，瑞氏吉姆萨染色观察细胞质和细胞核形态的变化，MTT法检测细胞存活率，AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术测定细胞凋亡率，用透射电镜观察细胞内超微结构的变化。结果 倒置显微镜下可见，SAHA 4，16和64 μmol·L-1与OC3/P细胞孵育24 h，可引起OC3/P细胞皱缩，细胞贴壁不良，折光率减弱，活细胞数目减少，且随着SAHA浓度升高细胞形态改变更明显。瑞氏吉姆萨染色发现，SAHA 64 μmol·L-1与OC3/P细胞孵育24 h，使细胞体积减小、细胞质凝集和核固缩。MTT法检测结果表明，SAHA 4~64 μmol·L-1对OC3/P细胞存活具有抑制作用，并存在明显的时间和浓度效应关系，其中SAHA 64 μmol·L-1作用 6，12，24和48 h对OC3/P细胞存活的抑制率分别为（7.1±1.9）%，（14.6±2.0）%，（36.8±2.7）%和（83.3±3.0）%（r=0.891，P〈0.05），SAHA 4，8，16，32和64 μmol·L-1作用48 h对OC3/P细胞存活的抑制率分别为（28.8±1.2）%，（34.8±4.3）%，（52.3±2.8）%，（61.3±4.9）%和（83.3±3.0）%（r=0.966，P〈0.05）。流式细胞术检测结果表明，SAHA 4，16和64 μmol·L-1作用48 h均可诱导OC3/P细胞凋亡（P〈0.05，P〈0.01）。透射电镜观察结果表明，SAHA 4，16和64 μmol·L-1作用24 h，OC3/P细胞核出现典型的凋亡形态变化。结论 SAHA可抑制人卵巢癌紫杉醇耐药细胞OC3/P的存活并诱导其凋亡。

自噬在紫杉醇诱导人卵巢癌顺铂耐药细胞死亡中的作用

卵巢癌是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤。对暂无法施行手术的晚期患者，临床上常使用化疗药物进行治疗，常用的一线化疗药物多以紫杉醇和铂类药物为主。化疗可使肿瘤缩小，为以后手术创造条件，同时亦可对术后残余癌灶进行杀灭。多数患者的化疗效果较明显，但其产生的获得性耐药已成为卵巢癌治疗失败的主要原因。近年研究表明，

UTP23基因在上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞中的表达及对紫杉醇化疗耐药的影响

目的:探讨UTP23基因在上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞中的表达及对紫杉醇化疗耐药的影响。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞中UTP23、P-糖蛋白(Pgp)、多药耐药基因(MDR1)的mRNA表达水平,使用特异性UTP23-siRNA转染上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞,使用RT-PCR和Western blot法检测转染后UTP23、P-gp、MDR1基因的表达,使用MTT法检测UTP23-siRNA对上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞生长的影响及耐药性。结果:耐药组UTP23基因mRNA表达水平明显低于敏感组(P<0.05),耐药组P-gp、MDR1基因mRNA表达水平明显高于敏感组(P<0.05);转染组与未转染组、阴性对照组相比较,UTP23 mRNA水平明显升高(P<0.05),未转染组与阴性对照组相比较,UTP23 mRNA水平和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05);转染组与未转染组、阴性对照组相比较,P-gp、MDR1 mRNA表达水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),未转染组与阴性对照组相比较,P-gp、MDR1 mRNA表达水平无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);紫杉醇对UTP23-siRNA转染后上皮性卵巢癌耐药细胞的IC50浓度明显高于未转染组和阴性对照组(P<0.05)。结论:UTP23基因在上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞中低表达,其可能通过间接调控MDR1及P-gp的表达而参与上皮性卵巢癌紫杉醇细胞对紫杉醇的耐药。

人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol的建立及其耐药机制研究

目的:建立紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol,探讨卵巢癌紫杉醇获得性耐药潜在的分子机制。方法:以人卵巢癌细胞株SKOV-3为亲本细胞,采用紫杉醇(Taxol)浓度梯度递增法诱导建立卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol。光学显微镜及电子显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞药物敏感性,流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR和Western Blot方法分别检测多药耐药基因以及凋亡和细胞周期调控相关基因的转录和翻译水平。结果:建立的紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol对紫杉醇具有显著耐药性,对阿霉素及5-氟脲嘧啶(5-FU)也产生强烈的交叉耐药,细胞形态也发生明显的变化。与亲本细胞相比,SKOV-3/Taxol细胞G2/M阻滞明显低于SKOV-3,其凋亡率也显著低于SKOV-3,差异均有统计学意义(P<0.05),耐药细胞株中MRP1、MAP-Tau和CDK1基因表达水平显著提高。结论:成功建立人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol的基础上,多药耐药相关蛋白MRP1、微管相关蛋白MAP-Tau以及细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)基因过表达与卵巢癌细胞对紫杉醇耐药有关。

人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株的建立和生物学特性评价

目的建立人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株（Skov-3／PTX），并对其生物学性状进行检测和鉴定。方法采用紫杉醇浓度梯度递增法，建立人卵巢癌紫杉醇耐药株。通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、药物敏感试验、细胞内Rh-123和紫杉醇含量研究及MDR1、MRP和GST-π mRNA水平的测定，评价Skov-3／PTX生物学特性。结果成功建立了Skov-3／PTX耐药株，耐药指数为45．90，对吉非替尼、9-硝基喜树碱和阿霉素产生明显的交叉耐药性。与Skov-3细胞相比，Skov-3／PTX耐药细胞异形明显；耐药细胞倍增时间显著延长（P〈0．05）；耐药细胞内Rh-123和紫杉醇量显著减少（P〈0．05），环孢菌素可以增加细胞内Rh-123和紫杉醇含量；耐药细胞的MDR1、MRP和GST-π mRNA水平显著增高。结论Skov-3／PTX细胞具有典型多药耐药特性，为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。

PAK5和MDRI／P-gP在卵巢癌细胞紫杉醇耐药中的表达和临床意义

卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其病死率居女性生殖系统肿瘤首位，由于大多数卵巢癌发病隐匿，且缺乏准确有效的早期诊断方法。目前手术联合化疗的综合治疗在一定程度上延长了晚期卵巢癌患者的生存时间；但多数患者在18～24个月后复发，其5年生存率〈30％。肿瘤细胞减灭术加以铂类和紫杉醇为基础的联合化疗已成为当前卵巢癌的标准治疗手段。

雷公藤内酯醇联合紫杉醇对人卵巢癌耐顺铂细胞株体外活性的影响及机制

目的探讨雷公藤内酯醇(TP)联合紫杉醇对人卵巢癌耐顺铂细胞株(CoC1/DDP)体外活性的影响及其可能机制。方法将对数生长期CoC1/DDP细胞随机分为4组,TP组采用10 ng/ml TP作用于细胞,紫杉醇组采用3.13μg/ml紫杉醇,联合组采用10 ng/ml TP和3.13μg/ml紫杉醇,空白对照组不作任何处理(调零组),采用MTT法检测各组细胞生长抑制率,透射电子显微镜下观察细胞超微结构变化,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡情况。结果联合组生长抑制率明显高于单药组,且呈时间依赖性(P<0.05);透射电子显微镜示TP组、紫杉醇组、联合组细胞均呈凋亡改变,联合组细胞凋亡率明显高于单药组,紫杉醇组与联合组细胞周期中G2/M期的比例明显增高(P均<0.05)。结论 TP联合紫杉醇可协同抑制CoC1/DDP细胞生长,促进其凋亡,其机制可能为使细胞阻滞于G2/M期。

自噬基因Beclin1在卵巢癌SKOV3细胞中对PI3K/AKT信号通路的影响及其与紫杉醇耐药关系实验研究

目的:探究自噬基因Beclin1在卵巢癌SKOV3细胞中对PI3K/AKT信号通路的影响,并分析其与紫杉醇耐药的关系。方法:以人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TXA作为研究对象,构建自噬基因Beclin1真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1,并通过试剂盒将其转染至SKOV3细胞中。采用MTT实验测定各组细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞凋亡及自噬情况,同时RT-PCR检测细胞中Beclin1 mRNA表达量,Western blot检测Beclin1、p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白水平。给予不同浓度紫杉醇处理,评估各组SKOV3/TXA细胞对紫杉醇耐药性的变化。结果:转染pcDNA3.1-Beclin1后,Beclin1-SKOV3/TXA组细胞Beclin1 mRNA和蛋白表达量明显升高(均P<0.05);细胞增殖能力较pcDNA3.1-SKOV3/TXA组和SKOV3/TXA组均显著降低(均P<0.05),凋亡率和自噬囊泡也明显增加(均P<0.05)。Western blot检测发现,Beclin1过表达后,SKOV3/TXA细胞p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT蛋白表达量比值显著低于pcDNA3.1-SKOV3/TXA组和SKOV3/TXA组(均P<0.05),磷酸化水平降低。2000 ng/ml和2500 ng/ml紫杉醇处理后,Beclin1-SKOV3/TXA组细胞凋亡率均高于其他组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:自噬基因Beclin1过表达可逆转SKOV3/TXA细胞的紫杉醇耐药性,其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路,诱导细胞自噬、凋亡有关。

染色体2p22的过度扩增及hmsh2基因的高表达与卵巢癌紫杉醇耐药相关性的研究

目的研究染色体特定区域DNA拷贝改变、基因差异表达及其与紫杉醇耐药的关系。方法运用比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)及RTPCR技术,分析卵巢癌紫杉醇耐药株染色体基因组变化和hmsh2基因在卵巢癌组织中的表达。结果CGH结果显示最有意义的变化是卵巢癌紫杉醇耐药株OC3/Tax300细胞染色体2p22过度扩增。RTPCR检测发现hmsh2基因在OC3/Tax300细胞高度表达。hmsh2基因表达阳性率在组1和组2分别为93.9%(31/33)及47.6%(10/21),差异有显著性;在低分化癌为93.3%,显著高于中、高分化癌的54.2%。结论2p22拷贝数的过度扩增及hmsh2基因的高度表达可能与卵巢癌紫杉醇耐药相关。

紫杉醇诱导的卵巢癌耐药基因表达谱与信号通路分析

目的:探讨卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药分子机制。方法:取对数生长期细胞按Trizol一步法抽提细胞总RNA,应用人类全基因组基因芯片检测卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TS与敏感细胞株SKOV3细胞基因表达谱的变化,GOTermMapper软件鉴定差异基因功能,进一步利用IPA软件分析基因通路网络,筛查获得性紫杉醇卵巢癌耐药的相关基因。结果:紫杉醇诱导的卵巢癌耐药差异表达基因分别与细胞生长增殖,细胞合成和装配,细胞死亡,细胞周期调控和细胞信号传导相关。涉及DNA修复功能,DNA复制和细胞周期阻滞的基因主要是过度表达,而在代谢相关基因(特别是脂质代谢),信号传导,免疫和炎症反应,运输,转录调控和蛋白质的合成则是抑制表达。网络分析结果表明微管蛋白网络和以BAX为节点的细胞凋亡信号转导通路被促进。结论:紫杉醇耐药主要是与细胞合成与装备(包括许多微管蛋白基因诱导相关的基因和通路),脂质代谢、细胞粘附和细胞凋亡相关。BAX蛋白从微管蛋白释放被抑制可能是诱导卵巢癌细胞耐药的重要原因。

人Bub1基因shRNA真核表达质粒的构建及其对人卵巢癌细胞SKOV3紫杉醇敏感性的影响

目的构建人Bub1 shRNA真核表达质粒,鉴定该质粒对人卵巢癌SKOV3细胞中Bub1基因的抑制作用,并探讨其对SKOV3细胞紫杉醇敏感性的影响。方法构建pEGFP-Bub1-shRNA质粒,将其经脂质体Lipo 2000TM转染SKOV3细胞后,通过RT-PCR及Western blot检测干扰效率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法比较转染前后SK-OV3细胞的紫杉醇敏感性。结果成功构建了pEGFP-Bub1-shRNA质粒;RT-PCR和Western blot检测结果提示,转染后Bub1的mRNA和蛋白表达均显著降低;MTT和FACS提示,与对照组细胞相比,转染后SKOV3细胞生长抑制率及凋亡率明显降低(P<0.05)。结论pEGFP-Bub1-shRNA质粒能有效抑制Bub1 mRNA及蛋白的表达,并降低SK-OV3细胞紫杉醇敏感性,该质粒的成功构建为进一步研究Bub1基因的生物学功能提供了工具。

人卵巢癌耐药细胞株的放射敏感性研究

为了研究具有耐药性的卵巢癌细胞系对放射线治疗的影响,以人卵巢癌细胞株A2780及其紫杉醇耐药株A2780/Taxol为研究对象,以MTT法检测细胞的药物敏感性并评判分析细胞放射敏感性;克隆形成实验分析细胞放射抗拒性;实时荧光定量PCR分析照射前后细胞耐药基因MDR1的变化。实验结果显示:A2780/Taxol的耐药指数为43.96;随着放射剂量增大,A2780细胞和A2780/Taxol细胞的相对存活率明显下降,以A2780细胞明显(p<0.05);A2780细胞及其耐药A2780/Taxol细胞D0值分别为4.90和6.06,D0越大,放射抗拒性越强,表明耐药A2780/Taxol细胞的放射抗性强于A2780细胞(p<0.01);照射前及不同剂量照射作用后,耐药基因MDR1在A2780/Taxol细胞中的表达均明显高于A2780细胞(p=0.000)。这些结果揭示耐药卵巢癌细胞株A2780/Taxol对辐射具有耐受性,表明卵巢癌细胞系具有放化疗交叉耐受性,并且射线和药物诱导卵巢癌细胞耐药基因MDR1的过表达,可能是引起放化疗交叉耐受性的原因之一。

雷公藤内酯醇联合紫杉醇对COC1/DDP细胞凋亡的影响及其对PI3K/AKT/GSK3β信号通路的调控

目的:通过研究雷公藤内酯醇(TP)联合紫杉醇对耐顺铂人上皮性卵巢癌细胞(COC1/DDP细胞)凋亡的影响,以探讨两药联合对COC1/DDP细胞作用的机制。方法:将对数生长期COC1/DDP细胞随机分为6组:空白对照组、紫杉醇组(3.13μg/ml)、LY294002组(10μmol/ml)、TP组(10ng/ml)、LY294002+紫杉醇组(10μmol/ml LY294002+3.13μg/ml紫杉醇)、TP+紫杉醇组(10ng/ml TP+3.13μg/ml紫杉醇)。采用MTT法检测各组的细胞增殖活性;普通光镜及AO/EB染色荧光显微镜观察细胞形态的变化;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot法检测各组细胞中Akt、pAkt、GSK3β、p-GSK3β蛋白的表达变化。结果:(1)细胞增殖抑制率:TP+紫杉醇组显著高于TP、紫杉醇组(P<0.05);LY294002+紫杉醇组显著高于LY294002、紫杉醇组(P<0.05)。联合用药组中,TP+紫杉醇组显著高于LY294002+紫杉醇组(P<0.05);单用药组中,TP组>紫杉醇组>LY294002组(P<0.05)。各组抑制率均呈时间依赖性(P<0.05)。(2)普通光镜及AO/EB染色荧光显微镜下观察,除空白组外,各用药组的细胞形态均有凋亡样改变。两联合用药组的细胞凋亡数显著高于各自单药组,TP+紫杉醇组高于LY294002+紫杉醇组;单用药组的细胞凋亡数:TP组>紫杉醇组>LY294002组。(3)流式细胞仪检测发现,两联合用药组的细胞凋亡率大于各自单药组(P<0.05)。联合用药组中,TP+紫杉醇组凋亡率显著高于LY294002+紫杉醇组(P<0.05);单药组的细胞凋亡率为:TP>紫杉醇>LY294002(P<0.05)。(4)p-Akt蛋白和p-GSK3β蛋白的表达从空白对照组→紫杉醇组→LY294002组→TP组→LY294002+紫杉醇组→TP+紫杉醇组,呈逐渐减少的趋势,而总Akt、GSK3β蛋白的表达不变。结论:TP可协同紫杉醇促进COC1/DDP细胞凋亡,其机制可能是通过抑制PI3K/Akt/GSK3β信号通路,从而下调了耐药相关蛋白p-Akt、p-GSK3β的表达。

Claudin-3调节MEK/ERK信号通路对紫杉醇耐药卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨紧密连接蛋白3(Claudin-3)调节MEK/ERK信号通路对紫杉醇(PTX)耐药卵巢癌(OC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 检测Ovcar-3、Ovcar-3/PTX及IOSE80细胞中Claudin-3表达;将PTX耐药Ovcar细胞(Ovcar-3/PTX)随机分为对照组(Control)、阴性对照组(sh-NC)、转染质粒组(sh-Claudin-3)、MEK/ERK激活剂组(C16-PAF)、sh-Claudin-3+C16-PAF组,分别检测细胞增殖、迁移、侵袭和E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及p-MEK、MEK、p-ERK、ERK蛋白表达。结果 Claudin-3在Ovcar-3/PTX细胞中的表达显著高于IOSE80与Ovcar-3(P<0.05);不同浓度的PTX均降低细胞存活率,且sh-Claudin-3组IC50显著低于sh-NC组(P<0.05);与sh-NC组比较,sh-Claudin-3组细胞克隆数、迁移、侵袭、N-cadherin、Vimentin、p-MEK/EMK、p-ERK/ERK显著降低,E-cadherin显著增加(P<0.05);与Control组比较,C16-PAF组细胞克隆数、迁移、侵袭、N-cadherin、Vimentin、p-MEK/EMK、p-ERK/ERK显著增加,E-cadherin显著降低(P<0.05);与C16-PAF组比较,sh-Claudin-3+C16-PAF组细胞克隆数、迁移、侵袭、N-cadherin、Vimentin、p-MEK/EMK、p-ERK/ERK显著降低,E-cadherin显著增加(P<0.05)。结论 Claudin-3在Ovcar-3/PTX细胞中呈高表达,沉默Claudin-3表达通过抑制MEK/ERK信号通路抑制细胞增殖、迁移和侵袭。