R262K点突变将紫穗槐二烯合酶变为(3R)-(E)-nerolidol合酶

倍半萜合酶家族催化单一底物法尼基焦磷酸形成近300多种链式、单环、双环和三环倍半萜烯、醇,进一步的加工修饰产生种类更加繁多的倍半萜衍生物。详细了解倍半萜合酶产物特异性性决定机制将会为倍半萜合酶的理性设计,定向生成新型化合物打下基础。本研究利用定点突变技术,对紫穗槐二烯合酶RxR基序及相关的D300位点进行了点突变,发现保守基序中R262K单点突变后其酶促反应主产物为(3R)-(E)-nerolidol,而R262L突变使酶失去活性,R264K突变则对产物比例无影响,显示保守基序中第一个精氨酸在活性中心疏水环境的维持中非常关键。D300突变结果显示此氨基酸对酶的活性维持非常必要,结合R262突变结果,推测R262和D300间的非键相互作用对酶活性的维持起重要作用。由于RxR基序在倍半萜合酶家族中非常保守,因此其作用是否具有普遍性值得进一步验证。

青蒿紫穗槐二烯合酶基因的克隆与表达

【目的】重建青蒿素合成代谢途径,以研制青蒿素高产微生物反应器。【方法】以低温预处理青蒿试管苗提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增紫穗槐二烯合酶基因(ADS),并导入大肠杆菌中表达。【结果】青蒿ADScDNA测序结果已在GenBank注册。当ADScDNA与谷胱甘肽硫转移酶基因(GST)融合并在大肠杆菌表达后,其菌体裂解上清中可检测到谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性,表明ADS基因已有可溶性表达。当裂解上清与法呢基焦磷酸(FDP)保温后,成功地检测到青蒿特有的倍半萜烯。【结论】青蒿ADS基因已在细菌体内实现功能性表达。

黄花蒿法呢基焦磷酸合酶、紫穗槐二烯合酶双功能酶基因的构建、原核表达与功能鉴定

试验将青蒿素生物合成途径中催化两步连续反应的酶(法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶)的基因进行融合,经大肠杆菌表达后鉴定其融合蛋白的功能。结果表明:融合蛋白具有了双功能酶活性。双功能酶基因的构建,为进一步将双功能酶基因转入黄花蒿,提高青蒿素含量奠定了基础。

基于rDNA序列的酵母整合载体的构建及应用

目的构建一个基于rDNA序列的酵母整合载体。方法通过PCR扩增得到酿酒酵母rDNA序列;通过常规分子生物学技术构建以rDNA序列为整合位点的酵母整合载体。为了确证该载体的效能,将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因克隆到该载体上,构建了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的整合型酿酒酵母工程菌。提取该工程酵母的基因组,通过紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的特异引物进行扩增,确认紫穗槐-4,11-二烯合酶基因是否已整合到酵母基因组上。发酵酵母工程菌,对发酵产物进行GC-MS检测,确认是否产生紫穗槐-4,11-二烯。结果构建了1个酵母整合载体,具有如下特点:①能将外源基因表达盒序列整合到酿酒酵母rDNA序列上,增加目的基因的拷贝数;②选择标记能反复应用,方便获得多拷贝的整合形式;③整合片段不需要酶切线性化,节省了内切酶,而且简化了操作程序。酵母基因组PCR结果表明,紫穗槐-4,11-二烯合酶基因已经整合到了酵母基因组上。以朱栾倍半萜为标准品,对该酿酒酵母工程菌的代谢产物进行GC-MS检测,发现其能产生紫穗槐-4,11-二烯,产量达到(91.33±7.57)mg/L朱栾倍半萜当量。结论初步成功构建了一个基于rDNA序列的酵母整合载体。

酵母工程菌制备紫穗槐-4,11-二烯的研究

构建了两种能产生紫穗槐-4,11-二烯的酿酒酵母工程菌,其中附加体型工程菌W303-1B[pYeDP60/G/ADS]含有表达载体pYeDP60/G/ADS。整合体型工程菌W303-1B[rDNA:ADS]是将ADS基因的表达盒序列通过同源重组的方式整合到酿酒酵母W303-1B基因组中。GC-MS检测发酵产物,结果表明这两种工程菌均能产生紫穗槐-4,11-二烯,但附加体型工程菌产生的紫穗槐-4,11-二烯的产量要高于整合体型工程菌的产量。Southern杂交检测表明,ADS基因以单拷贝的形式整合到W303-1B基因组中,低于附加体型工程酵母中的ADS基因拷贝数。这些结果表明,ADS基因的拷贝数与酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的产量呈正相关。