负载紫红质通道蛋白2重组腺病毒的包装及功能鉴定

背景紫红质通道蛋白2（ChR2）是从单细胞绿藻莱茵衣藻上分离的一种光敏感通道蛋白，可作为光刺激神经细胞的手段，与电、磁和超声波相比，光在时间和空间上对神经细胞的刺激将更精确。目的构建负载ChR2基因的重组腺病毒，并鉴定其功能。方法将人胚肾293（HEK293）细胞在含质量分数10％胎牛血清的DFl2培养基中进行培养及传代。腺病毒穿梭质粒pSB291-hCHR2-GFP与腺病毒包装质粒pBHGloxAEI，3Cre共转染HEK293，包装得到少量负载ChR2基因的重组腺病毒（Ad—ChR2），经HEK293细胞扩增、CsCl梯度离心，Tris—HCl透析后得到纯化Ad—ChR2。获取4只出生1d的清洁级LongEvans大鼠视皮层组织，用组织块培养法利用无血清培养基原代培养视皮层细胞，用纯化的Ad—ChR2转染培养的视皮层细胞，当转染成功的视皮层细胞表达绿色荧光时给予460hill蓝光刺激，应用膜片钳技术记录视皮层细胞的动作电位。结果纯化浓缩后的Ad—ChR2滴度可达7．9×10^10PFU／ml，HEK293细胞转染Ad—ChR224h后倒置荧光显微镜下即可见细胞膜上有绿色荧光表达，转染13d可见细胞由扁平变为圆形。无血清培养的视皮层细胞转染纯化的Ad—ChR2后细胞膜上可见绿色荧光蛋白（GFP）的表达，460nm蓝光刺激后用膜片钳技术可记录到蓝光诱发的视皮质细胞的动作电位。结论本研究成功构建了负载ChR2基因的重组腺病毒表达载体，并证实ChR2能够感染有功能的视皮质细胞，这对视觉可塑性方面的研究非常重要。

视紫红质通道蛋白2在系统神经科学研究中的应用与展望

光遗传学技术因其低组织损伤性、高时空分辨率以及遗传特异性等优势,虽然历史并不长,但却在近几年来成为最热门的技术之一,并在神经科学研究中迅速被应用。视紫红质通道蛋白2(channelrhodopsin-2,Ch R2)作为光遗传学技术的代表性蛋白质之一,在系统神经科学领域中已成为非常理想的工具并取得了一系列突破性的进展。现针对Ch R2的背景、分子结构以及生理学功能,及其在体脑功能区绘图和在体神经功能调控的研究进展,进行综述及展望。

光遗传学工具蛋白视紫红质通道蛋白-2的结构与特性介绍

视紫红质通道蛋白-2(ChR2)来自莱茵衣藻,由通道蛋白-2(Chop2)与视黄醛结合形成,属于视蛋白的一种,在470nm左右蓝光照射下,ChR2分子构象发生变化形成非选择性阳离子通道,对一价阳离子Na^+、K^+、H^+等和二价阳离子Ca^(2+)等具有通透性,使细胞膜电位变为内正外负,引起细胞去极化兴奋,进而改变细胞的膜电势产生感应电流。ChR2是光遗传学中应用最为广泛的兴奋性光敏蛋白之一,发现和诱导了多种突变体,可根据需要选择其中某种进行相关研究。

光遗传学技术在心律失常研究中的应用及进展

光遗传学技术作为一种新型技术,将光学与遗传学相结合,运用光学方法对心脏系统进行干扰,为心脏电活动的精确反馈与控制提供了新的工具与方法。目前,光遗传学技术在心律失常领域的应用主要集中在通过控制不同类型的心肌细胞,从而实现心脏起搏、除颤或复律、终止心律失常和细胞通讯等。它利用光门控心脏离子通道,以一种特定、可逆和无创伤的方式对心律失常进行电调制,从而干预心律失常的治疗。现对近年来光遗传学在心律失常治疗领域中的应用及进展做一系统阐述。

利用光遗传学技术构建小鼠光控心脏起搏模型

电刺激是人工控制心脏搏动频率的标准技术,但在实验研究中,这种方法有较大的局限性,如局部电解效应、刺激频率和时长受限、只能对目标范围内的所有细胞进行刺激、不能选择性作用于心肌细胞等。基于光遗传学技术,本研究构建了心肌细胞特异性表达光激活阳离子通道channelrhodopsin-2(ChR2)的转基因小鼠,采用特定频率的蓝光刺激使心肌细胞膜电位去极化,从而引发动作电位并控制心脏起搏。当蓝光刺激频率低于小鼠自发心脏搏动频率时,蓝光刺激造成暂时性的心律失常,去除蓝光照射后小鼠心跳恢复正常;当蓝光刺激频率高于小鼠自发心跳频率时,小鼠的心脏搏动完全由蓝光刺激支配,去除蓝光照射后恢复到自发搏动状态;失去自主搏动能力的小鼠心脏也可由蓝光刺激进行起搏;不表达ChR2的对照小鼠对蓝光刺激没有响应。本研究对基于光遗传学的光控心脏起搏技术进行了实验论证,在心肌电生理学特别是心律失常研究中有着非常重要的应用价值。

光遗传技术终止大鼠心房颤动的在体研究

目的 验证光遗传技术能否实现大鼠在体心房颤动(简称房颤)终止。方法 选取12只SD大鼠经右颈静脉系统性注射50μl重组腺相关病毒[rAA V9-CAG-hChR2 (XXM)-eYFP]。7周后,大鼠随机分为房颤组和对照组,每组6只。房颤组大鼠经尾静脉注射Ach-CaCl_(2)混合物(Ach 66 ug/kg, CaCl_(2)10 mg/kg),连续给药7天。对照组使用等量PBS液代替Ach-CaCl;混合溶液。病毒注射8周后,大鼠经麻醉后开胸充分暴露右心房,使用S_(1)S_(1)刺激心房并记录单相动作电位(MAP)和体表心电图(ECG),分析并统计RR间期、P波幅度、心率及APD_(90)。然后用频率为8 Hz的473 nm蓝光脉冲照射右房,并同步记录光照输出信号和体表心电图,寻找能完全夺获心房节律的最小光功率密度。大鼠通过Burst刺激(6 V,波宽20 ms,持续2~4 s)诱发房颤后,对心房施加4个间隔1 s的光脉冲,观察光照能否有效终止房颤。实验结束后对心房组织进行HE染色、Masson三色染色和免疫荧光染色观察。结果 与对照组比较,房颤组RR间期延长,P波幅度、心率和APD;均减少(P均<0.05).完全夺获心率的最小光照功率密度为(0.057±0.016) MW/mm^(2)。光照后房颤终止率为(80.7%±5.8%)远高于未光照的(30%±8.6%);光照后房颤的持续时间为(10.9±1.1)s远低于未光照的(41.6±10.4)s。免疫荧光染色显示转染目标光敏感蛋白ChR2成功。结论 光遗传技术可以有效地终止房颤并减少持续时间。