坛紫菜(Porphyra haitanensis)丝状孢子体EST的获取及其生物信息学分析

采用改进的一步法提取坛紫菜丝状孢子体的总RNA,构建了坛紫菜丝状孢子体的cDNA文库,对测序得到的EST进行分析并与条斑紫菜的EST相比较。结果表明,cDNA文库共包含2.5×105个克隆,测序得到490个EST,其中275个与已知功能基因同源,占56.1%,260个EST与已知的条斑紫菜EST同源,占53.0%。使用GO(Gene Ontology)分类方法对275个EST进行分类,其中226个可归属于细胞组分(Cellular component)、分子功能(Molecular function)和生物学过程(Biological process)三个大类,而其余49个则为未知功能的EST。挑选出与条斑紫菜同源性高的28个EST,这些EST所包括的密码子数为3221个,发现密码子第三位的平均GC含量远高于第一位的平均GC含量和第二位的平均GC含量。统计坛紫菜丝状孢子体3221个密码子的使用频率,发现同义密码子第三位碱基偏好使用G或C。

紫菜(Porphyra)遗传差异的ISSR分析

采用ISSR标记技术对来自不同产地的6个坛紫菜(Porphyra haitanensis)无性系和两个条斑紫菜(P.yezoensis)无性系进行了遗传差异的分析。结果表明,7条ISSR引物在8个紫菜系中共扩增出59条片段,全部表现出多态性。根据Nei等的相似性系数得出8个紫菜系间的遗传距离在0.274—0.746之间。用UPGMA方法作出的系统树中各紫菜基本上是按照产地进行聚类,从而推测紫菜的遗传差异可能与地域分布相关。本文结果也证明了ISSR与RAPD、AFLP等标记技术一样适用于紫菜的遗传多样性分析。

条斑紫菜(Porphyra yezoensis)耐高温品系的筛选及特性分析

采用60Co-γ射线诱变和高温胁迫处理条斑紫菜野生品系(WT),进行了耐高温品系的选育研究。结果表明,在18℃和22℃组,所选育的耐高温品系(TM-18)和WT品系的壳孢子存活率无显著差异,但在24℃和25℃组,TM-18与WT相比,壳孢子存活率分别提高了274%和296%,畸形苗率分别下降了286%和161%,假根发生率分别提高了151%和429%。将18℃培养50d的苗再分别在18℃、22℃和24℃下再培养30d,TM-18苗的绝对生长率分别为WT苗的3.82、3.16和4.95倍,特定生长率为WT苗的1.53、1.49、2.10倍。在24℃下培养15d或25℃下培养10d,WT苗停止生长,出现了卷曲和严重腐烂,而TM-18苗仍然生长良好,不腐烂。另外,TM-18的三种主要光合色素(Chl.a、PE和PC)含量明显比WT高。上述结果说明,TM-18是一个颜色好、生长快和耐高温的优良品系。

条斑紫菜(Porphyra yezoensis)选育品系壳孢子的放散量与耐高温性研究

模拟生产培育条件,对条斑紫菜选育品系(T-17)和野生型品系(WT)的贝壳丝状体在不同温度下的壳孢子放散量及壳孢子萌发体的生长发育进行了研究。结果表明,在18、23、24和25℃下,连续放散16d的平均每壳的壳孢子量,T-17分别为8.6×106、3.4×106、5.4×105和0个,WT分别为8.0×106、2.8×106、4.9×105和0个,两个品系之间无显著差异;18℃组的壳孢子萌发和生长均正常。将23℃下放散的壳孢子分别在三种高温条件下(23℃、24℃下培养3d再转入25℃、25℃)培养16d,壳孢子成活率,T-17分别为84.6%、59.7%和45.5%,而WT分别为33.0%、20.9%和17.1%,差异极显著。在三种高温条件下,WT的壳孢子萌发体均出现了畸形和烂苗,而T-17的壳孢子萌发体,23℃组发育正常,其余二组的发育也不正常,出现畸形。上述结果说明,T-17品系不仅具有与WT一样的壳孢子放散量,而且壳孢子和萌发体的耐高温能力均比WT强,有望在生产上得到应用。

坛紫菜(Porphyrahaitanensis)自由丝状体的胶囊化冰冻保存

在适宜孢子囊枝发育的条件下培养坛紫菜自由丝状体 ,用 3 %褐藻酸钙包埋 (胶囊化 )制成胶球 ,经脱水后直接投入液氮中冰冻保存 .结果表明 ,胶囊化的坛紫菜丝状体在 10 h的脱水过程中可保持约 90 %的存活率 .当胶球含水量下降至 42 .9%～ 16.6%时 ,冰冻保存存活率可达 65 %左右 .与常规的两步法冰冻保存相比 ,胶囊化方法可大大简化操作程序 ,是保存坛紫菜自由丝状体的一种较为理想的方法 ,在藻类种质保存中有广阔的应用前景 .

^(60)Co-γ射线对条斑紫菜(Porphyra yezoensis)的诱变效果与色素突变体分离

用60Co-γ射线辐照处理野生型条斑紫菜的壳孢子萌发体以获得色素变异细胞,随后用酶解法获得单离的变异细胞进行个体再生培养,从中分离出不同的条斑紫菜色素突变体。结果表明,叶状体经剂量分别为100、300、500、700和900Gy的γ射线辐照后再培养1周,均出现了多种色素变异细胞,随后,它们逐渐分裂成为变异细胞块。在0—500Gy辐照剂量范围内,色素变异细胞块的百分率随着辐照剂量的增加而增加,但增至700Gy时,变异细胞块的百分率反而下降,说明500Gy是最合适的剂量。从单离变异细胞的再生叶状体中分离出桔红、紫红、桔黄和墨绿等颜色的单色变异体,并获得了它们的丝状体纯系。各变异品系的F1叶状体均为单色,其颜色与各自的母本叶状体相同,表明它们是稳定突变体。各色素突变品系的叶状体活体吸收光谱不仅与野生型品系有明显的差异,而且各突变品系之间也存在较大的差异。

坛紫菜(Porphyra haitanensis)叶绿体DNA的快速提取

以阴干的坛紫菜叶状体为材料,通过酶解等方法获取完整的叶绿体,再裂解叶绿体并酚仿抽提获得叶绿体DNA.限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ双酶切及RAPD检测结果显示:叶绿体DNA与基因组DNA的酶切图谱及RAPD图谱均有比较明显的差异.多次重复实验证明,按此法提取的叶绿体DNA,其得率稳定,并可用作PCR扩增的模板及酶切图谱的构建等.该方法操作简便,过程快捷,可作为大型海藻叶绿体DNA提取的参考方法.

坛紫菜(Porphyra haitanensis)丝状藻体生长增殖的优化调控培养条件研究

丝状藻体是紫菜生活史中的重要阶段,其生长增殖与环境条件密切相关.本研究考察了与坛紫菜丝状藻体生长增殖相关的多个影响因子,探讨了可促进坛紫菜丝状藻体生长、达到生长速率快的优化调控培养条件.具体操作实施过程为:初始丝状藻体来自成熟紫菜叶状体的果孢子释放,基于8因子3水平的正交实验设计方案[采用正交表L27(313)],确定了丝状藻体生长对多个环境因子的响应以及优化的调控培养条件.结果表明,除开pH、复合维生素浓度和NaHCO3浓度外,其他因子对丝状藻体生长均有显著的影响(p≤0.043 8).获得的优化调控培养条件为:温度18℃、光强27μmol/m2·s-1、盐度25、pH值8.5、复合维生素浓度15μg/dm3、NaHCO3浓度2 mg/dm3、每天光照时数18 h、营养液浓度为f培养介质.优化调控培养条件下的丝状藻体生长速率高达12.07%,平均值±标准偏差SD为(10.70±0.88)%/d.

苯并(a)芘对紫菜(Porphyra)的致突变效应

苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene)是石油组份中的一种重要的具致癌作用的多环芳香烃化合物。由于燃烧和石油污染等多种原因,在大气、水体和海洋中都能检出它的存在,特别是在海洋中,这种化合物有的沉积于沉积物中,有的被生物体吸收,有的附着在生物体上,有的存在于水体中,因而构成了海洋中一类特殊的污染物。特别引起科学家注意的是这物种质可为某些海洋生物所富集或贮存,并经食物链而最后进入人体。

条斑紫菜(Porphyra yezoensis)游离氨基酸组成分析

采用邻苯二甲醛/9-氯甲酸芴甲酯(OPA/FMOC)柱前衍生反相高效液相色谱法(RP-HPLC),对江苏南通海区栽培的12个条斑紫菜(Porphyra yezoensis)样品游离氨基酸组成进行分析。结果显示:供试样品游离氨基酸总量在19.82～38.91mg.g-1之间,共检出16种游离氨基酸,其中Ala、Arg、Glu和Asp在所有测试样品中含量显著,占游离氨基酸总量的80%以上,Glu与Ala质量分数与游离氨基酸总量呈极显著正相关性(P<0.01);样品游离氨基酸中必需氨基酸质量分数在9.48～13.06 mg.g-1之间,占总量的33.44～52.75%;呈味氨基酸以Ala、Asp、Glu和Gly等鲜甜味氨基酸为主,质量分数在10.23～25.86 mg.g-1之间,占游离氨基酸总量的47.53～66.88%。

条斑紫菜(Porphyra yezoensis)丝状体的超微结构观察

本文报道了条斑紫菜自由丝状体的超微结构。观察到丝状体的细胞主要由细胞壁、细胞膜、色素体、细胞核、线粒体、内质网、淀粉粒和液泡等构成。细胞之间有栓子状的孔状联系存在。并对色素体的存在部位做了探讨。

条斑紫菜(Porphyra yezoensis)dbEST中筛选微卫星位点及引物种间转移扩增

采用电子查询的方法,借助Blast软件从条斑紫菜表达序列标签数据库的20979条序列中筛选微卫星位点,共发现非冗余微卫星位点211个,占整个条斑紫菜EST数据库的1.01%。其中双碱基重复微卫星位点共有35个,占查找微卫星序列总数的16.6%;三碱基微卫星有176个,占83.4%。双碱基重复微卫星中AG/CT形式最多,而三碱基中GGC/GCC最多。从筛选出的微卫星位点中选取序列设计合成引物,用在坛紫菜上进行引物种间转移扩增研究。在总共15对引物中有13对引物在两个种间都有扩增产物。结果表明,微卫星位点在这两种紫菜之间具有很高的同源性。获得的微卫星引物可用来进行种群遗传多样性研究、谱系鉴定和遗传图谱的构建。而微卫星标记的共显性可用来进行紫菜二倍体丝状体纯合性检验,为纯系紫菜品系的鉴定提供分子生物学鉴定方法。

紫菜(Porphyra)叶状体rbcL基因分类学分析

对采自江苏海安的坛紫菜(Porphyra haitanensis),浙江南麂的长紫菜(P.dentata)、圆紫菜(P.suborbiculata)和广东汕头的皱紫菜(P.crispata)4种紫菜叶状体rbcL基因进行扩增及序列测定,并用NJ法构建系统树.序列分析结果表明,4种紫菜rbcL扩增序列长度均约为1400bp,其中皱紫菜与坛紫菜仅6个碱基差异位点.距离矩阵结果显示,各紫菜种内遗传距离在0.000～0.010之间,遗传距离最小的是坛紫菜,遗传距离最大的是圆紫菜.各紫菜种间的遗传距离在0.001～0.094之间,其中遗传距离最小的是皱紫菜与坛紫菜,遗传距离最大的是圆紫菜与皱紫菜、条斑紫菜与圆紫菜.系统树的聚类分析结果显示,坛紫菜与皱紫菜亲缘关系最近,与长紫菜形成姊妹分支,条斑紫菜和圆紫菜依次与之相聚.本研究利用紫菜rbcL序列差异可区分紫菜种间关系,结果表明系统发育地位在紫菜种间关系中有更重要的影响,结果并不支持根据边缘进行的分类系统.

坛紫菜(Porphyra haitanensis)SRAP分子标记体系的构建及种质材料的遗传分析

利用正交设计对影响坛紫菜SRAP标记分析的5个因素(模板DNA,Mg2+,Taq酶,引物,dNTP浓度)在4个水平上进行优化,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了坛紫菜SRAP标记分析的最佳反应体系.然后利用该体系对15个坛紫菜种质材料进行了遗传多样性分析,筛选出15对可以扩增出清晰稳定条带的引物组合,共获得244个位点,其中184个位点具有多态性,占75.4%.15个供试材料间的平均遗传距离为0.2904,有效等位基因数为1.3758,期望杂合度为0.2303,Shannon多样性指数为0.3559.应用非加权成组配对法(UPGMA)对它们进行了聚类分析.结果表明供试的坛紫菜种质材料间存在着较高的遗传多样性,这为后续的坛紫菜遗传育种提供了丰富的遗传变异信息.

二氧化锗(GeO_2)对条斑紫菜(Porphyra yezoensis Ueda)自由丝状体(Free Filamentous)中硅藻污染影响的研究

研究了二氧化锗(GeO_2)对硅藻的抑制作用及对条斑紫菜自由丝状体扩增培养的影响,提出了既能抑制硅藻污染又保证条斑紫菜自由丝状体正常扩增培养的二氧化锗处理的适宜浓度和时间,为条斑紫菜自由丝状体(种质)管理提供了方法。

坛紫菜(Porphyra haitanensis)不同部位营养细胞分离培养的比较研究

本文对坛紫菜(P.haitanensis)叶状体不同部位营养细胞进行分离、培养和观察,初步得到以下结果;分离的营养细胞,其再生个体有小紫菜体、片状体、畸型细胞团三种形态类型;各部位中,小紫菜体和畸型细胞团所占的比数都很少,片状体占绝大多数;上部和中部大多为无假根和具纤细假根的片状体,其附着力差、生长缓慢,基部大多为具粗壮假根的片状体,其附着力强、生长迅速;各部位的出苗率,上部为12%;中部为25%;基部为67%左右。上述结果,反映坛紫菜营养细胞按部位顺序有明显的生理差异。这些生理差异主要与分离的细胞极性显著与否密切相关。

营养盐浓度等因子对条斑紫菜(Porphyra yezoensis Ueda)种质扩增影响研究

进行了营养添加浓度、扩增初始密度、扩增培养方式对自由丝状体扩增影响的研究,得到了悬浮培养、每两周在1000ml培养液中添加PES 5ml、扩增初始密度每1000ml培养液中投放自由丝状体0.8g,能够促进条斑紫菜自由丝状体快速扩增,为条斑紫菜种质保存和利用提供了技术方法。

条斑紫菜(Porphyra Yezoensis Ueda)和孔石莼(Ulve Pertusa Kjellm)对酸耐受力的研究——Ⅰ.pH对条斑紫菜和孔石莼呼吸强度和致死酸度试验

不同pH海水和不同时间处理紫菜、石莼对呼吸强度和致死酸度试验结果表明,紫菜比石莼耐酸力强。在海水温度为18℃条件下,分别用pH_2、pH_3、pH_4、pH_5、pH_6、pH_7、pH_8处理,处理时间20分钟,紫菜除pH_2处理对呼吸强度有抑制作用和培养5天后有20％死亡外,pH_3、pH_4、pH_5、pH_6、pH_7、pH_8各组处理对呼吸强度都有促进作用,培养5天后没有死亡现象,而石莼经pH_2、pH_3处理,对呼吸强度都有抑制作用,培养5天后,pH_2处理组全部死亡,pH_3处理有50％死亡。pH_3和pH_4在海水温度为18℃条件下,处理时间为40分钟时,对紫菜呼吸强度有促进作用,培养5天报,pH_3处理组仅有20％死亡。而pH_3对石莼呼吸强度有抑制作用,培养5天后,全部灭亡。在生产上是否可以考虑用pH_3的海水处理紫菜网帘以达到消除石莼(杂藻)的目的,将是一项具有生产意义的待试验课题。

条斑紫菜Porphyra yezoensis Ueda营养细胞的分离和培养

条斑紫菜营养细胞在一定条件下(主要是温度)可转化成单孢子，经放散、附着，再发育成新的藻体。但单个营养细胞在未形成单孢子以前，能否发育成新藻体尚未见报导。

沿海滩涂甘紫菜Porphyra tenera Kjellm.挥发油成分的稳定性研究

研究了沿海滩涂甘紫菜Porphyra teneraKjellm.的干燥藻体挥发油成分的稳定性。结果表明,高温、极端pH值、金属离子Fe3+、Cu2+以及氧化剂对沿海滩涂甘紫菜的干燥藻体挥发油的稳定性有不同程度的影响。在提取和使用沿海滩涂甘紫菜的干燥藻体挥发油的过程中应避免高温、极端pH值,同时避免与金属离子Fe3+、Cu2+以及氧化剂接触。