表达IFN-α的重组猪繁殖与呼吸综合病毒的构建及生物学特性分析

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是危害我国生猪业的重要疫病之一,其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),是一种免疫抑制性病毒。干扰素(IFN)是一类具有免疫调节功能和抗病毒作用的细胞因子。IFN-α除更直接的抗病毒作用外,还可以调节宿主的先天性和适应性免疫。论文构建表达IFN-α的重组PRRSV,分析重组病毒的生物学特性以及IFN-α的生物学活性。通过反向遗传操作方法将IFN-α插入到PRRSV ORF1b和ORF2a之间,重组质粒转染细胞后可以拯救出重组病毒(rGXAM-P-IFN-α)。插入到PRRSV基因组中的IFN-α可遗传稳定9代。重组病毒生长特性分析可发现rGXAM-P-IFN-α复制能力显著低于亲本病毒。rGXAM-P-IFN-α感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)可显著上调抗病毒基因(PKR,ISG15和ISG54)mRNA表达水平,为进一步研发新型PRRSV疫苗提供参考。

猪繁殖与呼吸综合征病毒入侵宿主细胞途径研究进展

病毒入侵宿主细胞是其完成自身复制周期的首要步骤。全面解析病毒入侵宿主细胞途径可深入揭示病毒感染及其致病机制,有助于制定更为有效的抗病毒策略。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是具有囊膜的单股正链RNA病毒,对全球养猪业造成巨大的经济损失。以往研究报道PRRSV主要通过网格蛋白介导的内吞途径(CME)入侵宿主细胞。近年来研究发现,除CME外,PRRSV还会采取其他途径入侵宿主细胞。本文通过总结PRRSV入侵宿主细胞途径的最新研究进展,以期加深人们对PRRSV的认识,并为防控该病毒提供新的思路。

一起输入性猪繁殖与呼吸综合征疫情的紧急流行病学调查

自2023年6月4日开始,四川省金堂县某生猪代养场引进的仔猪陆续出现异常死亡情况。为确定病因,分析来源,评估传播风险,赴现场开展了紧急流行病学调查。该猪场于2023年5月20—30日分4批共引进仔猪2200头,截至7月14日,共有222头仔猪发病,124头死亡,袭击率为10.09%,病死率为55.86%。经现场临床诊断、病死猪病理剖检、实验室检测及干预治疗效果印证,综合判定病因为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。经追踪调查,该发病猪场无生猪调出,与该猪场有流行病学关联的其他猪场未出现类似发病情况,因此判定疫情扩散风险较低。溯源调查发现发病仔猪的来源种猪场曾发生过猪繁殖与呼吸综合征疫情,现场调查发现该发病猪场生产管理规范,且周边养殖场未出现猪只异常死亡情况,因此综合判定疫情由引进带毒仔猪引起。本起疫情警示,养殖场在引种前应先确认种源场的疾病流行情况,同时加强引种检疫,尽可能避免输入性疫情发生。

猪繁殖与呼吸综合征病毒的持续感染和传播特点及防控出路

1PRRS简述。1987年,美国首次暴发猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),随后在世界各国陆续暴发该病,截至目前PRRS已遍布世界主要的养猪业国家,成为各国养猪业最为严重的疫病之一,每年给全球养猪业造成数十亿甚至上百亿美元的经济损失。

猪繁殖与呼吸综合征毒株的鉴定与分析

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproducductiveandrespiratory syndrome,PRRS)是引起成年猪出现繁殖障碍、产死胎和木乃伊胎、早产、流产,仔猪发生呼吸系统疾病和大量死亡的一种高度传染性疾病,传播范围广、速度快。该病病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproducductiveandrespiratory syndrome virus,PRRSV)。

猪繁殖与呼吸综合征的感染机制与预防措施

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)为高度接触性传染性疾病,给生猪生产带来巨大经济损失。本文对PRRS的病原、感染机制、发病特点、诊断和预防措施进行综述,旨在为防治PRRS提供理论参考。

猪繁殖与呼吸综合征病毒促进猪链球菌2型感染猪肺泡巨噬细胞的初步研究

为探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对不同毒力猪链球菌2型(SS2)感染巨噬细胞的影响,本研究建立了高致病性PRRSV Li11株和SS2强毒株HA或无毒菌株T1/5共感染永生化猪肺泡巨噬细胞(iPAM)的模型,实验分为4组:HA单独感染组(HA组)、PRRSV-HA共感染组(PRRSV-HA组)、T1/5单独感染组(T1/5组)和PRRSV-T1/5共感染组(PRRSV-T1/5组),利用该模型通过黏附试验、侵入试验和细胞内存活试验检测PRRSV对HA和T1/5黏附、侵入iPAM细胞及对该细胞存活率的影响,进一步利用荧光定量PCR方法检测各感染组iPAM模型细胞中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β)的转录水平。黏附试验结果显示,HA感染2 h后,PRRSV-HA组细菌对细胞的黏附水平极显著高于HA组(P<0.01或P<0.001);T1/5感染6 h后,PRRSV-T1/5组细菌对细胞的黏附水平极显著高于T1/5组(P<0.001),表明PRRSV与HA或T1/5共感染可以促进HA和T1/5对iPAM模型细胞的黏附,且HA对iPAM细胞的黏附水平高于T1/5。侵入试验结果显示,感染4 h后,共感染组细菌侵入iPAM细胞中的数量比单独感染组极显著增多(P<0.01或P<0.001)。细胞内存活试验结果显示,感染2 h后,共感染组细菌的存活率比单独感染组极显著升高(P<0.001)。荧光定量PCR试验结果显示,感染4 h时,共感染组iPAM细胞中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β)的转录水平极显著高于单独感染组(P<0.001)。本研究首次建立了高致病性PRRSV Li11株和SS2强毒株HA或无毒菌株T1/5共感染i PAM的模型,基于该模型研究首次发现PRRSV感染不仅促进了不同毒力SS2对i PAM细胞的黏附、侵入及SS2在iPAM细胞内的存活,还可以协同SS2显著提高该细胞中细胞因子的转录水平。本研究为进一步探究PRRSV和SS混合感染的机制提供了参考依据。

浅谈猪繁殖与呼吸障碍综合征的防治

从猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)的发展历史、病原学、临床症状、诊断方法、防治措施、案例分析等方面入手,探究该病的防治方法,旨在提高猪养殖户对猪繁殖与呼吸障碍综合征的认识和防范意识,为有效控制和消除该病提供参考。

非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白纳米抗体的筛选及其对病毒复制的抑制效应

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc^(-1)45细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRRSV-GP5蛋白进行原核表达并纯化,得到浓度为2.16 mg·mL^(-1)的重组蛋白,对羊驼三次免疫14 d后,其体内抗体效价高达1∶819200,构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库,库容量达2.93×107 CFU·mL^(-1),插入率为98%。经对噬菌体抗体文库连续三轮淘选富集后,最终获得2株不同氨基酸序列的纳米抗体。间接ELISA结果显示,2株纳米抗体均与PRRSV-GP5蛋白具有良好的亲和力。将2株纳米抗体转染至Marc^(-1)45细胞内,它们分别于36与60 h时显著阻碍PRRSV的复制与转录,展现出了较好的阻碍病毒复制的能力。本研究首次筛选出针对PRRSV-GP5蛋白的特异性纳米抗体,且经验证所筛纳米抗体具备抑制PRRSV在细胞内复制的能力,研究结果为抗PRRSV新型药物的研发奠定了试验依据与物质基础。

不同猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合体液免疫效果评估

为了比较不同猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗不同免疫程序对体液免疫效果的影响,本试验选择新引进猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和抗体均为阴性后备母猪的3个猪场,将各场内猪只按体重分为3个阶段:7~20、20~35和35~50 kg,各场分别从中选取20头猪,共180头猪。每场选用1种免疫方案,第1组混合疫苗组,为首次免疫PRRS弱毒疫苗(CH-1R株),28 d后加强免疫PRRS灭活疫苗(CH-1a株);第2组弱毒疫苗组,为2次均免疫PRRS弱毒疫苗;第3组灭活疫苗组,为2次均免疫PRRS灭活疫苗。疫苗首次免疫后14、28、42和56 d采集猪血清,进行特异性PRRSV ELISA(N蛋白)检测和中和抗体评价;首次免疫后14和28 d采集猪血液,进行PRRSV实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测血液内是否存在PRRSV;统计试验猪分娩后头胎的活仔数、断奶仔猪数和窝均总仔数,进行临床数据比较分析。结果显示,35~50 kg体重阶段猪只接种疫苗后ELISA检测抗体水平增高较其他2个阶段更明显。混合疫苗组在免疫56 d时血清ELISA阳性率为100%,且ELISA结果极显著高于弱毒疫苗组和灭活疫苗组(P<0.01)。尽管各组没有产生特异性抗NADC30-like毒株的中和抗体,但针对PRRSV经典和高致病性毒株的中和抗体保护效价结果显示,混合疫苗组在免疫56 d时中和抗体效价极显著高于弱毒疫苗组和灭活疫苗组(P<0.01);RT-qPCR检测未发现阳性猪;各组试验猪分娩后头胎的活仔数、断奶仔猪数和窝均总仔数之间差异不显著(P>0.05)。结果表明,混合疫苗组对体液免疫的促进效果显著优于弱毒疫苗组和灭活疫苗组。该试验为临床正确选择PRRS疫苗免疫方案提供了科学数据。

2016-2020年云南省部分猪场猪繁殖与呼吸综合征免疫抗体检测分析

为了解2016年-2020年云南省部分地区猪场猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫情况,采集了云南省9个州市188个健康猪场的4179份血清样品,应用ELISA方法进行猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测,分析不同州市、不同年份的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性率。结果显示,4179份血清样品中,阳性样品2932份、阴性样品1247份,总体抗体阳性率为70.16%;2016-2018年云南省部分地区抗体阳性率分别为76.97%、76.32%、75.75%,达到我国农业农村部要求的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性率70%的标准;2019-2020年抗体阳性率分别为63.68%、56.50%,未达到农业农村部规定的标准。9个州市中,保山、楚雄、红河、普洱、版纳、玉溪的抗体阳性率分别为84.85%、70.75%、76.46%、80.67%、76.82%、81.39%,达到农业农村部规定标准;大理、昆明、曲靖抗体阳性率分别为61.89%、67.42%、57.88%,未达到农业部规定标准。结果表明,云南省部分地区总体猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性率呈现下降趋势,各州市抗体阳性率也存在差异性。为了降低猪繁殖与呼吸综合征疫情发生风险,建议定期做好猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学、病原学监测,优化猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫策略,制定更加科学合理的综合防控方案,从而进一步保障云南省生猪养殖业高质量发展。

猪繁殖与呼吸综合征病毒2型TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法的建立

为了准确、特异、高效地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒2型(PRRSV2),本研究根据GenBank上登录的PRRSV2不同谱系流行毒株的ORF6基因序列,选取保守区域设计合成了1对特异性检测引物和1条MGB探针,经优化退火温度、引物和探针比例等反应条件及敏感性、特异性、重复性试验,建立了检测PRRSV2的TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果:以猪繁殖与呼吸综合征病毒1型(PRRSV1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪细小病毒(PPV)等阳性核酸为模板,均无扩增;对标准质粒的最低检测下限为1×10^(1)copies/μL,建立的标准曲线呈现良好的线性关系,相关系数R2为0.994;稳定性和重复性好,批内和批间变异系数均小于1.78%。应用该方法对保留的30份临床阳性样品进行检测,结果阳性100%,Ct值在22~36间。综上,本研究建立的TaqMan MGB荧光定量PCR方法可用于临床和实验室中PRRSV2的快速检测,为猪繁殖与呼吸综合征的防控提供了技术支持。

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种烈性传染病。PRRSV的非结构蛋白2(NSP2)编码一个多功能蛋白,具有广泛生物学作用。本文对NSP2遗传变异分析,与自身病毒蛋白互作,与宿主蛋白互作,影响PRRSV复制、毒力、细胞噬性,调节宿主免疫以及在疫苗应用等相关研究进行综述,为深入研究PRRSV致病机理和疫苗设计提供重要理论基础。

中药复方对猪繁殖与呼吸综合征的防治效果及母猪生产性能的影响

旨在研究中药复方对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的防治效果以及对母猪生产性能、仔猪健康状况的影响。选择罗牛山某猪场6栋母猪区约4 500头PRRS发病母猪(长白×大约克)作为对照组,每吨饲料添加磷酸替米考星1 kg和复方阿莫西林0.5 kg,自试验开始连续添加7 d;另在发病情况相似的7栋母猪区选择约4 500头同品种母猪作为试验组,拌料饲喂中药复方,每吨饲料添加1 kg九灵甘蓝素和1 kg九灵黄芪素,自试验开始连续添加15 d。检测发病母猪主要生产性能指标、PRRSV抗原、循环阈值(Ct值)及仔猪的出生重、断奶重等。结果:在使用抗生素和中药复方之后,发病母猪中流产数和窝均死胎数明显减少(P<0.05);PRRSV抗原阳性率与发病前相比明显降低(P<0.05);仔猪腹泻率降低但无显著差异(P>0.05),死淘率显著降低,母猪产仔数及窝均健仔数均显著增加(P<0.05),表明中药复方对PRRS的防控效果与抗生素类似;但试验组在8月的流产率、窝均死胎数显著低于对照组(P<0.05),脐带血、睾丸去势液和流产母猪样本抗原阳性率均显著低于对照组(P<0.05),表明中药复方降低了PRRS复发的风险。综上,添加中药复方可降低PRRSV抗原阳性率,减少PRRS的发病率,稳定病情,并能提高母猪的生产性能和仔猪抗病能力。

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GD2022株的分离鉴定及遗传进化分析

为了解广东省欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-1)流行情况,将RT-PCR检测PRRSV-1阳性的病料(肺脏和淋巴结)接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs)进行病原分离鉴定,以分离毒株核酸作为模板,对分离的PRRSV-1进行全基因克隆和测序,并与国内外PRRSV-1和PRRSV-2参考毒株序列进行同源性及遗传进化分析。结果显示,成功分离1株PRRSV-1,命名为GD2022株,其接种PAMs可引起典型的细胞病变,从出现病变的F5细胞中提取核酸,用PCR分段扩增出PRRSV-1 GD2022株10个基因组片段,分别连接到pCE2 TA/Blunt-Zero载体进行测序,拼接后获得PRRSV-1 GD2022株全基因组长15058个核苷酸(不包含polyA尾)。同源性分析显示,该分离株全基因组序列与PRRSV-1参考毒株(LV株)和PRRSV-2参考毒株(VR2333株)核苷酸序列同源性分别为87%和59.7%。遗传进化树分析显示,全基因序列和ORF5基因与国内外PRRSV-1毒株为同一进化分支,且与疫苗毒分支较远,推断分离株为1株PRRSV-1,属于基因亚型1。氨基酸序列比对分析显示,ORF3和ORF4重叠区域缺失3个核苷酸,导致GP3蛋白和GP4蛋白分别在第245和第65氨基酸位点缺失了1个氨基酸,且与LV株比对,GD2022毒株GP5的氨基酸序列在中和抗原表位第33氨基酸位点(D→A)出现点突变,在高变区第56氨基酸位点(D→A)和第63氨基酸位点(G→D)出现两处突变。重组分析显示,GD2022毒株未发生重组事件。成功分离鉴定1株PRRSV-1毒株,为国内PRRSV-1生物学特性研究提供了材料,也为了解广东省内PRRSV-1流行情况及变异特点提供参考依据。

京津冀地区猪繁殖与呼吸综合征流行特点及防控建议

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine respiratory and reproductive syndrome,PRRS)俗称“猪蓝耳病”,临床以母猪繁殖障碍和仔猪及生长猪群呼吸道症状为主要特征。该病1987年在美国东南部首次报道,之后迅速扩散至美国主要养猪地区和加拿大。1990年和1991年该病相继在欧洲和亚洲暴发和流行。

猪繁殖与呼吸综合征的感染特性与防控分析

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是影响全球猪业生产的病毒性疫病之一,我国又将其称“蓝耳病”。PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)感染引起的,在我国广泛流行,给养猪业造成严重经济损失。由于PRRSV能够引起猪只的免疫抑制,从而增加细菌性继发感染的几率,进而影响其它疫苗的免疫效果,此外,PRRSV抑制宿主免疫反应有利于PRRSV持续感染。当前商品化疫苗不能同时满足有效性和安全性,弱毒活疫苗的应用,进一步提高了PRRSV变异和重组的几率,使得PRRS成为世界上最具有挑战性的病毒性传染病之一。本文总结分析了PRRS防控难点,针对不同状况下猪群提出防控建议,以期为PRRS防控和净化提供思考。

猪繁殖与呼吸综合征病原学特征与疫苗研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种引起仔猪死亡、呼吸道症状和怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎以及公猪呼吸症状和精液质量下降等繁育障碍为特征的高度接触性传染病。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)可分型为欧洲型(PRRSV-1),美洲型(PRRSV-2),中国目前正在流行的PRRSV病毒分有1、3、5、8四个谱系。疫苗是目前防控PRRSV的有效措施之一,但由于PRRSV的变异性高以及病毒和病毒、病毒和疫苗之间交叉重组现象严重,导致PRRSV防控难度加大。PRRSV生物学特征以及疫苗的研究成为目前研究的热点。本文对PRRS病原学特征和疫苗研究进展进行综述,为PRRS有效防控提供参考。

猪繁殖与呼吸综合征研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)又叫猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的给养猪行业带来严重危害的高度接触性传染病。主要引起繁殖母猪繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状。国内外许多学者对PRRS开展了相关研究,本文从PRRSV的病原学特征、基因组结构与功能、疫苗创制和疫病防控等方面进行综述,旨在为PRRSV的进一步研究以及制定相应的防控策略提供参考。